體內(nèi)CAR工程：下一代免疫細(xì)胞治療技術(shù)

引言

嵌合抗原受體（CAR）工程化免疫細(xì)胞療法是癌癥治療領(lǐng)域的一項(xiàng)重要突破。目前已有七款FDA批準(zhǔn)的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品在治療復(fù)發(fā)或難治性急性淋巴細(xì)胞白血病、B細(xì)胞淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤方面取得了臨床成功。然而，目前所有FDA批準(zhǔn)的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品均基于體外工程化的自體T細(xì)胞。

然而，復(fù)雜性和高昂成本是與自體CAR-T細(xì)胞療法相關(guān)的主要挑戰(zhàn)。為每位患者定制T細(xì)胞產(chǎn)品而非制備標(biāo)準(zhǔn)化批量藥物，帶來了巨大的生產(chǎn)和物流難題。為解決自體CAR-T細(xì)胞療法的生產(chǎn)問題，研究人員開發(fā)了幾種策略。其中一種有前景的方法是使用來自健康供體的“現(xiàn)成”異體CAR工程化細(xì)胞產(chǎn)品。這種方法具有若干優(yōu)勢，包括冷凍保存產(chǎn)品的即時(shí)可用性、生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化、充足的細(xì)胞改造時(shí)間以及通過工業(yè)流程降低成本。但是，異體CAR-T細(xì)胞存在危及生命的移植物抗宿主病（GvHD）風(fēng)險(xiǎn)。盡管正在開發(fā)減輕這些風(fēng)險(xiǎn)的策略，但異體CAR-T細(xì)胞的給藥仍需要淋巴細(xì)胞清除以防止宿主免疫排斥，這一過程通常伴隨長期血細(xì)胞減少、中性粒細(xì)胞減少和頻繁的感染并發(fā)癥。

直接體內(nèi)生成CAR-T細(xì)胞代表了一種有前景的替代方案，以應(yīng)對(duì)當(dāng)前體外生成的自體和異體CAR-T細(xì)胞療法面臨的挑戰(zhàn)。一種促進(jìn)CAR工程化免疫細(xì)胞體內(nèi)生成的“現(xiàn)成”產(chǎn)品將能夠簡化治療藥物生產(chǎn)、消除患者特異性制造需求并簡化制造物流，從而節(jié)省成本并縮短治療時(shí)間。此外，使用非整合型載體的體內(nèi)方法在避免T細(xì)胞耗竭和安全性問題方面可能優(yōu)于體外永久基因修飾的CAR-T細(xì)胞。

目前，多種策略正在臨床前階段被探索用于體內(nèi)生成CAR-T細(xì)胞。這些方法包括使用脂質(zhì)納米顆粒（LNP）包裝的核酸（mRNA或質(zhì)粒DNA）、包裹核酸的聚合物納米顆粒、慢病毒或腺相關(guān)病毒（AAV）遞送系統(tǒng)、生物指導(dǎo)性可植入支架的混合方法，以及Cas9包裝包膜遞送載體和病毒模擬融合納米囊泡。每種遞送平臺(tái)在細(xì)胞特異性靶向、潛在系統(tǒng)效應(yīng)以及插入突變風(fēng)險(xiǎn)方面都有獨(dú)特的優(yōu)勢和劣勢。

一、體內(nèi)CAR-T細(xì)胞工程的具體策略

LNP包裝的核酸遞送系統(tǒng)

mRNA負(fù)載的LNP技術(shù)利用了完善的臨床制造基礎(chǔ)設(shè)施，這一點(diǎn)在COVID-19疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)中得到驗(yàn)證。此外，F(xiàn)DA的批準(zhǔn)確認(rèn)了其安全性，并突顯了其在更廣泛治療應(yīng)用中的潛力，包括體內(nèi)CAR工程。一旦給藥，LNP-mRNA被各種類型細(xì)胞攝取，特別是靜脈注射時(shí)被肝細(xì)胞攝取。細(xì)胞攝取后，mRNA從內(nèi)體逃逸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，在那里被短暫翻譯后降解。抗體偶聯(lián)在LNP表面可以促進(jìn)特定細(xì)胞類型的攝取。由于mRNA局限于細(xì)胞質(zhì)、固有地不穩(wěn)定、不能整合到基因組中并在細(xì)胞分裂過程中被稀釋，因此使用LNP-mRNA的工程方法本質(zhì)上是短暫的。因此，使用LNP-mRNA的體內(nèi)CAR工程治療方法可能需要頻繁的連續(xù)給藥以維持治療效果。

臨床前研究表明，使用LNP-mRNA技術(shù)體內(nèi)工程化CAR-T細(xì)胞在癌癥免疫治療方面具有巨大前景。這種方式產(chǎn)生的CAR-T細(xì)胞的瞬時(shí)性質(zhì)可能限制潛在毒性并允許精確劑量給藥，且該方法在注射前不需要淋巴細(xì)胞清除。目前大多數(shù)使用LNP體內(nèi)生成CAR-T細(xì)胞的努力都涉及將靶向CD3、CD4、CD5、CD7和CD8的抗體或單鏈可變片段整合到LNP中。

一項(xiàng)在Burkitt淋巴瘤人源化NSG小鼠模型中的研究顯示，使用CD3靶向抗體表面偶聯(lián)的LNP系統(tǒng)包裹編碼人CD19 CAR和IL-6靶向短發(fā)夾RNA的DNA質(zhì)粒，在注射后21天實(shí)現(xiàn)了80%的人T細(xì)胞CAR轉(zhuǎn)染率，CAR-T細(xì)胞持續(xù)存在超過90天并介導(dǎo)了顯著的腫瘤抑制。IL-6靶向短發(fā)夾RNA的整合減輕了細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）的風(fēng)險(xiǎn)。然而，觀察到脫靶CAR表達(dá)，因?yàn)橐恍㎜NP也轉(zhuǎn)染了體內(nèi)的巨噬細(xì)胞。

聚合物納米顆粒遞送系統(tǒng)

陽離子可生物降解的聚合物制劑通過靜電相互作用與陰離子核酸自組裝，并在內(nèi)吞后經(jīng)歷pH依賴性內(nèi)體逃逸。這些聚合物已被功能化，通過偶聯(lián)含有微管相關(guān)序列和核定位信號(hào)的肽，利用微管運(yùn)輸機(jī)制促進(jìn)其遺傳貨物的快速核輸入。PBAE聚合物納米顆粒是可生物降解的，半衰期短，并且在動(dòng)物模型中表現(xiàn)出良好的耐受性。這些納米顆粒可以使用納米沉淀、乳液聚合或溶劑蒸發(fā)等技術(shù)高效穩(wěn)定地生產(chǎn)。此外，凍干使聚合物納米顆粒能夠以干燥粉末形式儲(chǔ)存，便于儲(chǔ)存，增強(qiáng)穩(wěn)定性并降低成本。

為了將PBAE聚合物納米顆粒特異性靶向T細(xì)胞，聚谷氨酸被偶聯(lián)到靶向CD8或CD3的抗體上，所得復(fù)合物靜電吸附到PBAE顆粒上。這些靶向納米顆粒隨后可裝載編碼CAR構(gòu)建體的質(zhì)粒DNA（可設(shè)計(jì)為整合或不整合到基因組中）、轉(zhuǎn)座子DNA（可促進(jìn)構(gòu)建體整合到安全港位點(diǎn)）或mRNA。

PBAE聚合物納米顆粒已成功用于在白血病、前列腺癌和乙型肝炎誘導(dǎo)的肝細(xì)胞癌的臨床前模型中體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了與傳統(tǒng)過繼性CAR-T細(xì)胞療法相當(dāng)?shù)哪[瘤消退效果。然而，使用包裹mRNA的納米顆粒實(shí)現(xiàn)高效的CAR工程和抗腫瘤功效需要多次給藥納米載體，因?yàn)镃AR表達(dá)是瞬時(shí)的。重要的是，這些納米載體的現(xiàn)成可用性允許根據(jù)需要進(jìn)行方便的重復(fù)給藥。相比之下，PBAE聚合物納米顆粒DNA遞送方法存在與轉(zhuǎn)座子基因整合相關(guān)的潛在插入突變風(fēng)險(xiǎn)，其臨床可行性仍有待充分確定。

總的來說，PBAE聚合物納米顆粒的簡單穩(wěn)定的制造過程簡化了儲(chǔ)存和成本考慮。這種方法可能代表一種可行、靈活且廣泛適用的解決方案，用于在體內(nèi)誘導(dǎo)CAR-T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。然而，與LNP相比——后者具有更高的包封效率、更強(qiáng)的降解保護(hù)能力和已確立的安全性特征，特別是在臨床mRNA疫苗應(yīng)用方面——PBAE納米顆粒需要進(jìn)一步研究其可擴(kuò)展性、長期生物相容性和潛在毒性。

慢病毒遞送系統(tǒng)

慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一個(gè)亞類，具有球形、包膜結(jié)構(gòu)和一個(gè)單鏈RNA基因組，以其整合到宿主基因組并從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因長期表達(dá)的能力而聞名。慢病毒載體已被廣泛用于將外源基因遞送到T細(xì)胞。然而，它們?cè)隗w內(nèi)的感染效率通常受到慢病毒對(duì)靶細(xì)胞低親和力以及T細(xì)胞通常處于靜止?fàn)顟B(tài)的限制。為優(yōu)化這些載體的體內(nèi)T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，它們被用各種病毒包膜進(jìn)行假型化，包括尼帕病毒、麻疹病毒、辛德畢斯病毒和Cocal融合糖蛋白的包膜。此外，慢病毒可以經(jīng)過工程改造，在包膜蛋白和其他病毒表面蛋白上表達(dá)靶向配體，以進(jìn)一步增強(qiáng)T細(xì)胞趨向性。

例如，使用靶向CD8的scFv慢病毒載體在人源化NSG小鼠中體內(nèi)生成了CD19靶向的CD8+ CAR-T細(xì)胞。注射該載體7天后，30-50%的CD8+ T細(xì)胞表達(dá)了CAR，并有效消除了淋巴瘤細(xì)胞。另一項(xiàng)研究在NSG小鼠中使用具有CD4特異性DARPin的慢病毒載體，在腹腔注射人PBMCs后7天，通過腹腔給藥實(shí)現(xiàn)了約40-60%的CD4+ T細(xì)胞的CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)率。

最近，一種改良的慢病毒遞送平臺(tái)在非人靈長類動(dòng)物模型中進(jìn)行了測試。該載體除了抗CD3 scFv外，還整合了共刺激配體CD80和CD58，從而顯著增強(qiáng)了體內(nèi)CAR-T細(xì)胞的活化和抗腫瘤功能。這些載體體內(nèi)生成的CD20靶向CAR-T細(xì)胞占循環(huán)T細(xì)胞的65%，并導(dǎo)致B細(xì)胞完全清除長達(dá)76天，表明其在治療B細(xì)胞惡性腫瘤和B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病方面的強(qiáng)大功效。

慢病毒已被廣泛采用于體外治療應(yīng)用，臨床級(jí)生產(chǎn)方案和試劑現(xiàn)已完善，它們能夠?qū)崿F(xiàn)CAR轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定整合和表達(dá)。然而，在體內(nèi)使用這些載體時(shí)，由于永久的病毒整合，安全性問題更加突出，引發(fā)了關(guān)于受控整合、潛在無意突變和長期后果的問題。因此，慢病毒載體的體內(nèi)應(yīng)用需要對(duì)靶細(xì)胞類型進(jìn)行嚴(yán)格控制，并可能在獲得批準(zhǔn)廣泛應(yīng)用之前，在嚴(yán)格的安全性評(píng)估后才可以考慮進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

AAV遞送系統(tǒng)

AAV是一種小型、無包膜病毒，具有二十面體衣殼結(jié)構(gòu)和單鏈DNA基因組，不整合到宿主基因組中。AAV衣殼可以經(jīng)過工程改造以呈現(xiàn)各種蛋白質(zhì)，包括scFv和DARPin。衣殼的修飾對(duì)于實(shí)現(xiàn)特異性細(xì)胞靶向和減少其他細(xì)胞的非特異性攝取至關(guān)重要。

AAV已成為治療性基因遞送的關(guān)鍵載體，這歸功于其實(shí)現(xiàn)長期轉(zhuǎn)基因表達(dá)和有效疾病表型校正且毒性最小的能力。與慢病毒載體相比，AAV DNA以穩(wěn)定的游離體形式存在，抵抗外切核酸酶的降解，并利用宿主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行脫殼。這種穩(wěn)定性和以游離體形式持續(xù)存在的能力使AAV成為非常適用于體內(nèi)基因操作的載體，因?yàn)樗粯?gòu)成插入突變的風(fēng)險(xiǎn)。

一項(xiàng)AAV介導(dǎo)的體內(nèi)CAR基因治療策略已用于在人源化小鼠模型中靶向人CD4+ T細(xì)胞白血病。在這項(xiàng)研究中，AAV載體經(jīng)過工程改造以遞送一個(gè)線性單鏈DNA質(zhì)粒，該質(zhì)粒編碼靶向人CD4的scFv，以及共刺激受體CD28和4-1BB以及CD3ζ TCR亞基的信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。單次給藥該載體成功產(chǎn)生了能夠誘導(dǎo)腫瘤消退的CAR-T細(xì)胞。

AAV編碼的CD4靶向CAR構(gòu)建體的持續(xù)存在和記憶T細(xì)胞的生成可能在臨床環(huán)境中加劇CD4+ T細(xì)胞再生障礙，強(qiáng)調(diào)了為該治療策略開發(fā)有效安全開關(guān)的必要性。盡管如此，基于AAV的方法代表了推進(jìn)體內(nèi)T細(xì)胞工程技術(shù)的堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，其潛在應(yīng)用擴(kuò)展到癌癥和傳染病以外的領(lǐng)域，如自身免疫性疾病和器官移植。

生物指導(dǎo)性可植入支架

可植入的多功能海藻酸鹽支架，搭載病毒載體以介導(dǎo)體內(nèi)CAR-T細(xì)胞工程和釋放，代表了體內(nèi)和體外策略之間的混合方法。它們?nèi)匀恍枰跏紡幕颊唧w內(nèi)分離T細(xì)胞，但處理時(shí)間減少到一天。與其他體內(nèi)工程方法不同，海藻酸鹽支架提供了一個(gè)局部和受控的微環(huán)境，增強(qiáng)了T細(xì)胞、病毒載體、細(xì)胞因子和趨化因子之間的相互作用。這種空間限制提高了CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，同時(shí)最小化了與全身T細(xì)胞工程相關(guān)的潛在系統(tǒng)性副作用。

一個(gè)例子是基于海藻酸鹽的支架，包含靶向人CD3和CD28的抗體，以及人IL-2以促進(jìn)T細(xì)胞增殖。該支架在植入前裝有自體PBMC和逆轉(zhuǎn)錄病毒。這種設(shè)置促進(jìn)了病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，并支持功能性CAR-T細(xì)胞的體內(nèi)生成和釋放。在CD19+淋巴瘤的人源化小鼠模型中，這種方法釋放了大量的CD19 CAR-T細(xì)胞，在控制腫瘤生長方面與傳統(tǒng)的體外生成的CAR-T細(xì)胞同樣有效，但表現(xiàn)出更優(yōu)的擴(kuò)增和持久性。

另一種生物指導(dǎo)性可植入支架設(shè)計(jì)基于膠原蛋白，上面偶聯(lián)了抗人CD3/CD28抗體、慢病毒和選定的趨化因子。該支架不是搭載T細(xì)胞，而是設(shè)計(jì)用于招募、工程化、擴(kuò)增和釋放腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞以治療實(shí)體瘤。

總體而言，生物指導(dǎo)性可植入支架技術(shù)為體內(nèi)CAR工程提供了一種新穎方法，將CAR-T細(xì)胞制造和遞送整合到一個(gè)單一平臺(tái)中。它創(chuàng)建了一個(gè)局部、支持性的微環(huán)境，用于CAR-T細(xì)胞的激活、增殖和釋放。盡管生物指導(dǎo)性可植入支架可能非常適合治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤和可觸及的實(shí)體瘤，如黑色素瘤和乳腺癌，但它們?cè)诎邢騼?nèi)部或具有挑戰(zhàn)性解剖部位（如肝臟、肺和腦）的實(shí)體瘤方面的適用性可能更復(fù)雜。

Cas9包裝包膜遞送載體

脫靶效應(yīng)可能源于病毒和病毒衍生顆粒對(duì)非靶細(xì)胞的非預(yù)期轉(zhuǎn)導(dǎo)，這對(duì)體內(nèi)基因工程構(gòu)成了重大限制。為解決此問題，已開發(fā)出一種技術(shù)，使用可預(yù)測的抗體-抗原相互作用，將基因組編輯機(jī)制瞬時(shí)遞送至特定靶細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)精確和永久的基因組位置編輯，同時(shí)最小化對(duì)旁觀細(xì)胞的脫靶效應(yīng)。該方法使用基于逆轉(zhuǎn)錄病毒樣顆粒的Cas9-EDV，可通過偶聯(lián)特異性針對(duì)CD3、CD4或CD28的scFv來靶向T細(xì)胞。該方法被用于同時(shí)體內(nèi)工程化CD19 CAR表達(dá)并敲除TCRα恒定區(qū)基因座，從而創(chuàng)建異體工程化T細(xì)胞并降低GvHD風(fēng)險(xiǎn)。

與使用偶聯(lián)scFv或DARPin的遞送載體的其他體內(nèi)工程策略類似，scFv-抗原相互作用的特異性確保Cas9-EDV將其有效載荷遞送至特定細(xì)胞類型，而不會(huì)遞送至非特異性攝取顆粒的其他細(xì)胞，如肝細(xì)胞。總體而言，與使用病毒載體的體內(nèi)工程方法相比，該平臺(tái)能夠?qū)⒎肿迂浳锞_遞送至特定細(xì)胞類型，促進(jìn)復(fù)雜的基因組修飾，如CAR工程和靶向基因敲除。

病毒模擬融合納米囊泡

預(yù)制的CAR蛋白也可以直接插入到體內(nèi)T細(xì)胞膜中。這種方法確保CAR蛋白的存在時(shí)間有限，降低了持續(xù)性CAR介導(dǎo)的T細(xì)胞激活引起的CRS風(fēng)險(xiǎn)，并且沒有插入突變的風(fēng)險(xiǎn)。

通過病毒模擬融合納米囊泡實(shí)現(xiàn)了工程化蛋白的直接插入，這些囊泡含有T細(xì)胞融合原——特別是抗人CD3 scFv——以及CAR，如CD19 CAR。靜脈注射后，F(xiàn)uNVs與T細(xì)胞膜融合，并促進(jìn)CAR整合到T細(xì)胞膜中，從而在體內(nèi)產(chǎn)生CAR-T細(xì)胞。在人源化小鼠模型中，通過這種方法產(chǎn)生的CD19 CAR-T細(xì)胞有效消除了CD19+ B淋巴瘤細(xì)胞，而不誘導(dǎo)CRS。

二、其他免疫細(xì)胞的體內(nèi)CAR工程

鑒于體內(nèi)CAR-T細(xì)胞工程方法的令人鼓舞的臨床前結(jié)果，其他免疫細(xì)胞——特別是NK細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞——的體內(nèi)工程也已被探索。其中，CAR-巨噬細(xì)胞受到特別關(guān)注，主要有兩個(gè)原因。首先，巨噬細(xì)胞的先天吞噬特性使其非常有效地內(nèi)化納米顆粒，這增強(qiáng)了它們對(duì)體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的適用性。其次，巨噬細(xì)胞具有自然浸潤腫瘤的能力，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中的主要細(xì)胞類型。

CAR-巨噬細(xì)胞和CAR-小膠質(zhì)細(xì)胞已通過使用一種腔內(nèi)可注射的納米-水凝膠超結(jié)構(gòu)生成，該結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)用于將膠質(zhì)瘤干細(xì)胞特異性CAR基因遞送到巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中。在膠質(zhì)瘤模型中，這些CAR-巨噬細(xì)胞和CAR-小膠質(zhì)細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境內(nèi)刺激適應(yīng)性抗腫瘤免疫反應(yīng)，并通過誘導(dǎo)長期抗腫瘤免疫來防止術(shù)后膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)。

對(duì)于腦干膠質(zhì)瘤，開發(fā)了一種合成通用DNA納米載體，用于實(shí)現(xiàn)瘤內(nèi)遞送并用特異性靶向ERBB2的CAR重編程巨噬細(xì)胞。這種方法利用可生物降解的PBAE聚合物納米顆粒，功能化RP-182肽，該肽結(jié)合并激活M2樣巨噬細(xì)胞上的甘露糖受體CD206。通過靶向巨噬細(xì)胞，該策略促進(jìn)其從M2極化表型重編程為M1極化表型。

盡管瘤內(nèi)基因遞送方法對(duì)某些局限性實(shí)體瘤有效，但靜脈基因遞送對(duì)于全身性治療細(xì)胞分布和治療轉(zhuǎn)移性癌癥仍然至關(guān)重要。一種含有帶正電荷的甘露糖化殼聚糖寡糖-精氨酸的脂質(zhì)體納米轉(zhuǎn)運(yùn)器被證明在靜脈注射后靶向瘤內(nèi)巨噬細(xì)胞，該納米轉(zhuǎn)運(yùn)器可裝載編碼CAR構(gòu)建體的DNA。

其他免疫細(xì)胞類型，包括NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，也已被用CAR工程化用于癌癥免疫治療。盡管尚未實(shí)現(xiàn)CAR-NK細(xì)胞、CAR-NKT細(xì)胞或CAR-中性粒細(xì)胞的靶向體內(nèi)工程化，但由于它們表達(dá)CD8α鏈——工程慢病毒顆粒中單鏈抗體的靶抗原——CD19特異性CAR-NK和CAR-NKT細(xì)胞已被無意中在體內(nèi)生成。

總體而言，T細(xì)胞以外免疫細(xì)胞的體內(nèi)工程為CAR-T細(xì)胞提供了一種有前景的替代方案，利用了這些細(xì)胞類型固有的特性。

-04-
三、超越癌癥的體內(nèi)CAR工程

近年來，CAR技術(shù)已擴(kuò)展到癌癥之外的領(lǐng)域，包括感染性疾病、自身免疫性疾病和纖維化。CAR技術(shù)應(yīng)用于非癌癥適應(yīng)癥的例子包括CD19、BCMA、DSG3和CD20靶向的CAR-T細(xì)胞現(xiàn)在用于靶向自身免疫性疾病中的自身反應(yīng)性B細(xì)胞，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力和尋常型天皰瘡。此外，靶向HIV gp120糖蛋白的CAR-T細(xì)胞療法目前正在對(duì)兩名患者進(jìn)行I/II期劑量遞增研究。CAR治療的其他潛在適應(yīng)癥包括哮喘、乙型和丙型肝炎病毒感染、心臟纖維化、SARS-CoV-2感染和阿爾茨海默病。

在非癌癥適應(yīng)癥的體內(nèi)CAR工程臨床前結(jié)果已在心臟纖維化小鼠模型中獲得。在這里，T細(xì)胞被工程化表達(dá)成纖維細(xì)胞激活蛋白靶向的CAR，該蛋白結(jié)合使心肌僵硬并阻礙心臟功能的活化成纖維細(xì)胞。這是通過使用CD5靶向的LNP包裹FAP-CAR mRNA實(shí)現(xiàn)的，導(dǎo)致T細(xì)胞中瞬時(shí)FAP-CAR表達(dá)。心臟切片顯示心臟中超過一半的CD3+ T細(xì)胞表達(dá)了FAP-CAR并定位于FAP+成纖維細(xì)胞區(qū)域，治療小鼠表現(xiàn)出纖維化減輕和心臟功能恢復(fù)。

05-
四、體內(nèi)與體外CAR工程的比較

物流比較

體外工程化自體CAR-T細(xì)胞在商業(yè)市場和臨床試驗(yàn)中的需求不斷增長，揭示了自體工程化T細(xì)胞制造能力的重大局限性。在美國，所有體外生成的自體CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品目前都在中心設(shè)施生產(chǎn)，周轉(zhuǎn)時(shí)間從16到33天不等，可能導(dǎo)致患者治療的危險(xiǎn)延遲。通過擴(kuò)大規(guī)模來縮短生產(chǎn)時(shí)間是不可行的，因?yàn)榛罴?xì)胞產(chǎn)品的集中制造涉及復(fù)雜的物流。相反，需要通過建立更多分散的和本地的制造設(shè)施來"橫向擴(kuò)展"，以提高自體細(xì)胞療法的生產(chǎn)能力。然而，本地細(xì)胞制造設(shè)施與集中設(shè)施相比面臨更高的成本，因?yàn)樾枰獙ｉT的設(shè)備和昂貴的試劑，因此限制了其物流可行性。體外工程自體CAR-T細(xì)胞療法的制造和管理成本也很高，這是由于涉及白細(xì)胞分離、基因工程和細(xì)胞擴(kuò)增的多步驟過程。相比之下，異體CAR-T細(xì)胞方法提供了一種更具成本效益的替代方案，具有更大的可擴(kuò)展性和現(xiàn)成可用的優(yōu)勢。

體內(nèi)CAR工程策略由于其"現(xiàn)成"特性——簡化了放行測試和供應(yīng)鏈，從而降低了成本和縮短了時(shí)間——以及其自體性質(zhì)，為自體和異體體外生成的CAR-T細(xì)胞提供了一種有前景的替代方案。使用LNP-mRNA平臺(tái)的體內(nèi)CAR工程方法的臨床轉(zhuǎn)化可能受益于COVID-19疫情期間為疫苗生產(chǎn)開發(fā)的商業(yè)化制造基礎(chǔ)設(shè)施。

療效比較

盡管在血液腫瘤中取得了成功，但體外生成的自體CAR-T細(xì)胞療法治療實(shí)體瘤的療效仍然有限。新興的體內(nèi)CAR工程方法提供了一種有前景的替代方案，因?yàn)檫@種方法在腫瘤微環(huán)境內(nèi)持續(xù)修飾和擴(kuò)增治療性免疫細(xì)胞。這一動(dòng)態(tài)過程通過克服與體外生成的CAR-T細(xì)胞相關(guān)的持久性和次優(yōu)歸巢限制，增強(qiáng)了它們的有效性。

此外，所有體外生成的CAR-T療法通常涉及淋巴細(xì)胞清除步驟以為輸注的CAR-T細(xì)胞"創(chuàng)造空間"，這可能導(dǎo)致免疫抑制和相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)。相比之下，體內(nèi)CAR工程消除了對(duì)淋巴細(xì)胞清除的需求，保留了患者的免疫系統(tǒng)。這種方法可能增強(qiáng)表位擴(kuò)散，并維持免疫系統(tǒng)識(shí)別和靶向腫瘤的能力。如果腫瘤細(xì)胞通過下調(diào)CAR配體逃避檢測，內(nèi)源性免疫反應(yīng)仍然可以識(shí)別它并發(fā)動(dòng)抗腫瘤防御。

使用體內(nèi)CAR工程的非整合型載體的一個(gè)潛在好處是允許CAR構(gòu)建體的暫時(shí)表達(dá)和中間有休息期的連續(xù)給藥，這可以避免由慢性刺激引起的CAR-T細(xì)胞耗竭。相比之下，在體外生成的自體CAR-T細(xì)胞中，由于體外長時(shí)間激活和擴(kuò)增，在輸注前已觀察到耗竭，從而降低了它們輸注后的有效性。

體內(nèi)CAR工程還使得共遞送小干擾RNA以暫時(shí)沉默特定基因，或遞送編碼細(xì)胞因子的mRNA以暫時(shí)增強(qiáng)T細(xì)胞活性和持久性成為可能，而沒有"過度工程化"的風(fēng)險(xiǎn)——正如在體外方法中所觀察到的，引入多個(gè)永久基因修飾可能損害T細(xì)胞適應(yīng)性。這種靈活性允許更動(dòng)態(tài)的治療策略，同時(shí)減輕TME的免疫抑制效應(yīng)。

盡管有這些優(yōu)勢，體內(nèi)CAR工程在療效和特異性方面仍面臨挑戰(zhàn)。與自體CAR-T細(xì)胞相比——后者通過受控的體外操作在給藥時(shí)立即提供大規(guī)模的治療性細(xì)胞——體內(nèi)CAR工程最初生成的CAR-T細(xì)胞數(shù)量要少得多。這些細(xì)胞必須在患者體內(nèi)隨時(shí)間逐漸擴(kuò)增，可能延遲治療效果。然而，與體外生成自體CAR-T細(xì)胞所需的7-22天延遲相比，一旦初始擴(kuò)增階段完成，體內(nèi)方法可能提供更快的治療反應(yīng)。

體內(nèi)CAR-T療法的另一個(gè)重要限制，特別是在腫瘤學(xué)中，是患者免疫系統(tǒng)的受損狀態(tài)。體外制造允許選擇和擴(kuò)增最優(yōu)的T細(xì)胞，但這些補(bǔ)償過程在體內(nèi)CAR-T工程中不可用。對(duì)于接受淋巴細(xì)胞清除的癌癥患者，適合體內(nèi)工程的功能性T細(xì)胞稀缺可能限制治療療效，可能導(dǎo)致次優(yōu)的臨床結(jié)果。

藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)為體內(nèi)CAR工程引入了進(jìn)一步的復(fù)雜性，因?yàn)榛罴?xì)胞、納米顆粒和載體在體內(nèi)的分布和遷移變化很大。此外，盡管瞬時(shí)CAR表達(dá)在避免T細(xì)胞耗竭方面有優(yōu)勢，但對(duì)于非整合型載體，CAR表達(dá)的短持續(xù)時(shí)間可能影響療效。允許穩(wěn)定整合的平臺(tái)，如使用慢病毒載體的平臺(tái)，可以規(guī)避這個(gè)問題，但構(gòu)成插入突變的風(fēng)險(xiǎn)。

安全性和毒性比較

體內(nèi)CAR工程可以提供若干顯著的安全性和毒性優(yōu)勢，優(yōu)于自體CAR-T細(xì)胞療法。所有體內(nèi)CAR工程策略的一個(gè)實(shí)質(zhì)性優(yōu)勢是它們不需要治療前的淋巴細(xì)胞清除化療，從而避免了相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)。此外，非整合型載體允許實(shí)時(shí)劑量調(diào)整，這可以顯著降低毒性和長期副作用，包括CRS和免疫效應(yīng)細(xì)胞相關(guān)神經(jīng)毒性綜合征。mRNA和AAV載體已證明的安全性特征，在COVID-19疫苗和幾種FDA批準(zhǔn)的療法的開發(fā)和部署中確立，突出了體內(nèi)CAR工程快速商業(yè)化的潛力。此外，納米顆粒和mRNA可以以無細(xì)胞方式生產(chǎn)，從而產(chǎn)生明確的理化性質(zhì)，最小化產(chǎn)品變異性。這種受控的生產(chǎn)過程確保了穩(wěn)定的質(zhì)量控制，這是臨床應(yīng)用的關(guān)鍵因素。此外，mRNA和AAV療法的給藥沒有插入突變的風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)檫z傳物質(zhì)被遞送至細(xì)胞質(zhì)并在其中翻譯，從而避免整合到宿主基因組中。

盡管有這些優(yōu)勢，體內(nèi)CAR工程面臨幾個(gè)重要挑戰(zhàn)。由于成功到達(dá)靶器官或細(xì)胞的顆粒比例有限，通常需要高劑量載體。載體的全身給藥可能導(dǎo)致劑量限制性毒性，包括肝損傷。對(duì)載體的炎癥反應(yīng)，如補(bǔ)體系統(tǒng)介導(dǎo)的超敏反應(yīng)，也構(gòu)成了實(shí)質(zhì)性障礙。然而，這些免疫反應(yīng)也可能通過激活抗原呈遞細(xì)胞、增強(qiáng)細(xì)胞因子產(chǎn)生和促進(jìn)T細(xì)胞啟動(dòng)，從而增強(qiáng)抗腫瘤免疫，因此可能增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增和功能。

脫靶遞送仍然是一個(gè)關(guān)鍵問題，因?yàn)樗赡軐?dǎo)致非靶細(xì)胞中非預(yù)期的CAR表達(dá)，可能破壞正常細(xì)胞功能并引起不可預(yù)見的并發(fā)癥。盡管慢病毒載體與非整合型載體的瞬時(shí)性質(zhì)相比提供了更穩(wěn)定和持久的CAR表達(dá)，但它們永久整合到宿主基因組中構(gòu)成了長期脫靶效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)（除了插入突變的風(fēng)險(xiǎn)）。因此，它們需要被仔細(xì)靶向以防止脫靶轉(zhuǎn)導(dǎo)，特別是生殖細(xì)胞，在這些細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)移可能導(dǎo)致種系轉(zhuǎn)化和可遺傳的遺傳修飾。考慮到這些擔(dān)憂，非整合型載體或位點(diǎn)特異性整合載體目前比慢病毒載體更受青睞，用于體內(nèi)CAR工程，以增強(qiáng)安全性并最小化基因組破壞。

-06-
結(jié)語

體內(nèi)CAR工程方法應(yīng)用于治療癌癥等疾病，與當(dāng)前體外工程自體CAR-T細(xì)胞相比，可能具有經(jīng)濟(jì)和物流優(yōu)勢。特別是，它將構(gòu)成一種仍能生成患者特異性工程細(xì)胞的"現(xiàn)成"產(chǎn)品，并將消除對(duì)患者預(yù)處理（如淋巴細(xì)胞清除）的需求。通過簡化的制造過程，它有可能為治療各種疾病的數(shù)百萬患者提供實(shí)用和可擴(kuò)展的解決方案。迄今為止，在癌癥和心臟損傷模型中的臨床前概念驗(yàn)證研究已證明體內(nèi)工程化的治療性細(xì)胞與傳統(tǒng)體外方法產(chǎn)生的細(xì)胞在功能上等價(jià)。然而，這些研究迄今為止僅限于同基因或人源化小鼠模型。要確定體內(nèi)CAR工程在人類中的可行性、功效和安全性，扔然需要進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)。

參考資料：

1.In vivo CAR engineering for immunotherapy. Nat Rev Immunol. 2025 Oct;25(10):725-744