以mRNA脂質納米顆粒為基礎的體內CAR-T細胞

引言

嵌合抗原受體T（CAR-T）細胞療法已徹底改變了血液惡性腫瘤的治療，然而其更廣泛的應用，特別是在實體瘤中，仍然受到高成本、勞動密集型制造、有限的生產能力以及不穩定的臨床療效的限制，同時也面臨諸如歸巢能力差、抗原異質性和免疫抑制性腫瘤微環境等障礙。體內CAR-T細胞工程，即在患者體內直接生成CAR-T細胞，通過消除體外細胞處理和復雜物流基礎設施的需求，提供了一種范式轉變。在新興方法中，信使RNA（mRNA）負載的脂質納米顆粒（LNPs）已成為一種有前景且臨床可行的體內CAR-T細胞生成平臺。

一、mRNA生物學與LNP遞送平臺

用于CAR-T細胞生成的現代mRNA構建體整合了多層次的序列和結構優化。這些通常包括：一個支持高效帽依賴性翻譯起始的合成5′帽類似物；精心挑選的源自高翻譯內源轉錄本（例如，α-珠蛋白或爪蟾β-珠蛋白）的5′和3′非翻譯區，以促進穩定性和核糖體加載；開放閱讀框的密碼子優化，以與人類密碼子使用偏好對齊并最小化抑制性序列；一個約100-150個核苷酸的多聚腺苷酸（poly(A)）尾，以增強穩定性并促進核糖體循環；以及系統性地摻入修飾核苷，特別是m1Ψ，以減弱Toll樣受體信號傳導并減少I型干擾素誘導?？偟膩碚f，這些工程策略將治療性mRNA的有效半衰期從幾分鐘延長到幾小時或幾天，并大幅增加了每個遞送分子產生的蛋白質量，這些特性對于有效的體內CAR表達至關重要。

脂質納米顆粒（LNPs）是目前系統性遞送mRNA最有效的模態，標準的LNP配方包含四種脂質成分，每種成分都發揮特定的生物物理功能?？呻婋x脂質是最關鍵的設計元素，包含一個可滴定的胺基團，其表觀pKa通常在6.0-6.5之間。在此范圍內，可電離脂質在生理pH（7.4）下主要保持中性，從而減少非特異性靜電相相互作用和系統性毒性。當內體腔室內的pH下降至約5.0-5.5時，這些胺基團被質子化，賦予正電荷并促進“錐形”脂質幾何構象，破壞內體膜并促進mRNA載體釋放到細胞質中。

輔助磷脂如DOPE或DSPC提供雙層的結構支架并調節膜流動性。膽固醇插入磷脂之間，填充堆積缺陷，增強顆粒穩定性，并已被證明支持內體逃逸。聚乙二醇（PEG）-脂質結合物包被LNPs的外表面，通過創建親水性屏障防止顆粒聚集、減少調理作用并延長循環時間。LNPs由封裝在可電離脂質、磷脂、膽固醇和PEG-脂質中的mRNA組成。細胞攝取后，LNPs離開內體，將mRNA釋放到細胞質中，實現翻譯，并誘導T細胞表面CAR表達。

對于T細胞靶向應用，常規LNP的固有肝趨向性是一個必須克服的主要限制。對可電離脂質化學進行系統性修改、調整脂質成分比例以及摻入所謂的選擇性器官靶向（SORT）脂質，可以將LNP生物分布從肝臟轉向淋巴器官和循環免疫細胞。

二、工程化T細胞靶向LNPs

對于基于LNP的方法，有效的T細胞編程需要顆粒能夠在循環中存留足夠長時間以遇到相關T細胞群體，通過高親和力相相互作用與T淋巴細胞表面標志物例如C3、CD4、CD5或CD8選擇性結合，并通過受體內吞作用高效內化進入這些細胞，以實現穩健的內體逃逸，將功能性mRNA遞送到細胞質。

T淋巴細胞對非病毒核酸的遞送構成了重大障礙。靜息T細胞是小而活躍、非吞噬細胞的細胞，內吞受體水平低。這與快速分裂的肝細胞或腫瘤細胞不同。它們高效的DNA修復系統和核輸入限制進一步阻礙了質粒DNA的遞送。mRNA不需要核進入的要求，使其成為T細胞重編程的最佳載體。

抗-CD3和抗-CD8抗體：CD3是T細胞受體的恒定信號傳導復合物，僅在T淋巴細胞上表達，使其成為主動遞送的有吸引力的靶抗原。靶向CD8同樣可以實現選擇性遞送至細胞毒性T淋巴細胞，即抗腫瘤免疫中的主要效應細胞。由于CD4?輔助T細胞也有助于腫瘤控制并維持CAR-T持久性，當需要廣泛的T細胞重編程時，通常優先使用針對CD3或CD2的泛T細胞策略。CD5也已作為靶抗原被探索；CD5靶向的LNPs在體內能夠有效轉染T細胞，并驅動CAR表達達到足以在淋巴瘤模型中誘導抗腫瘤活性的水平。

納米抗體和單域抗體：駱駝科單域抗體由于其小尺寸（約15kDa）、高穩定性以及易于遺傳和化學工程化的特點，非常適合LNP表面功能化。分選酶介導的連接和馬來酰亞胺-硫醇偶聯已被用于將特異性針對CD7的納米抗體偶聯到可電離LNPs上。

受體特異性配體和LFA-1靶向：結合T細胞限制性表面受體的肽和小分子為基于抗體的方法提供了有吸引力的替代方案，特別是從制造角度。淋巴細胞功能相關抗原1（LFA-1），即在T細胞上豐富表達的整合素αL/β2異二聚體，已被利用于使用LABL（一種源自ICAM-1的肽）進行選擇性LNP靶向。LABL功能化的LNPs顯示出對T細胞的優先結合和內化，表明短肽配體可以有效地調整LNP趨向性，無需完整的抗體結合。

被動靶向與SORT技術：LNP生物分布也可以僅通過調整脂質組成來調節。選擇性器官靶向（SORT）技術表明，向原本常規的四組分LNPs中引入第五種脂質成分（通常是永久帶電的陽離子或陰離子脂質），可以系統地重新調整器官趨向性，根據SORT脂質的身份和比例將遞送重定向到肺、脾或肝。在此框架中，脾臟靶向的SORT LNPs優先轉染脾臟T淋巴細胞，提供了一條相對簡單的免疫細胞靶向途徑。

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三、用于mRNA遞送的CAR構建體設計

經典嵌合抗原受體（CAR）是一種合成的I型跨膜蛋白質，由四個功能模塊組成。細胞外抗原結合結構域通常源自腫瘤抗原特異性抗體的重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL），配置為單鏈可變片段（scFv）。一個鉸鏈或間隔區將該結合結構域連接到膜，并提供靈活性，從而影響表位可達性和靶點結合的最佳細胞間距離。跨膜結構域將受體錨定在T細胞膜中，并可調節受體穩定性和信號傳導。最后，一個或多個細胞內信號傳導結構域在抗原結合后傳遞激活信號。

由于mRNA天然是短壽命的，即使經過核苷修飾和3'UTΩ優化，其有效半衰期也在約12-72小時量級，mRNA編碼的CAR提供了一個明確的效應活性窗口，隨后表達自發喪失。這一特性提供了一個明顯的安全性優勢，通過消除插入突變發生風險和長期靶向非腫瘤毒性。同時，它也帶來了一個藥理學挑戰：必須在治療窗口內使T細胞達到足夠的CAR表面密度，并且必須為需要持續抗原壓力的腫瘤設計再給藥策略。

目前，多種方法正在探索中，以延長mRNA-CAR表達的持續時間和幅度。環狀RNA（cirRNA）本質比線性mRNA更穩定，因為它缺少核酸外切酶通常識別的5′帽和聚(A)尾，因此可以支持單次遞送事件產生持續蛋白質生產。自擴增RNA（sRNA）編碼了病毒復制機器和CAR轉基因，使得RNA模板能在細胞內擴增以及蛋白質自非常小的輸入劑量起持續表達，通常持續數周。在體內CAR-T應用中，實際上，環狀RNA和自擴增RNA都可以作為常規線性mRNA的下一代替代品。

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四、mRNA-CAR-T的臨床轉化與監管

體內mRNA-CAR-T技術的臨床前成功催化了大量投資和早期臨床活動，特別是在專注于靶向LNP平臺的生物技術公司中。Capstan Therapeutics、Sana Biotechnology以及幾家學術衍生公司已經披露了多項申請IND的項目并啟動了首次人體試驗，以測試體內T細胞重編程策略。這些項目中的大多數目前處于IND或I期劑量爬坡階段，Capstan Therapeutics特別強調了靶向mRNA-LNPs的開發，旨在體內生成CD19導向的CAR-T細胞；人源化模型中的臨床前數據證明了選擇性T細胞轉染和穩健的抗腫瘤活性。

體內mRNA-CAR-T療法的監管借鑒了基因治療產品和體外CAR-T細胞的現有框架，但并未完全與之重疊。在當前的美國和歐盟范式下，LNP-mRNA作為生物制品進行監管，而體內產生的CAR-T細胞則構成基因修飾的體細胞治療。這種雙重性質引發了關于如何定義“產品”、什么是適當的放行標準，以及當活性細胞藥物在患者體內產生時如何評估效力的新問題。

諸如FDA的生物制品評估和研究中心（CBER）以及歐洲藥品管理局（EMA）等監管機構正開始通過指南更新和監管科學倡議來解決這些問題，通常類比于體內基因治療和傳統CAR-T框架。核心期望包括：證明一致的LNP制造（粒徑分布、包封效率、mRNA完整性和靶向配體結合效率）；對患者樣本中體內生成的CAR-T細胞的表型和功能進行詳細表征；對CAR表達和擴增的藥代動力學和藥效學進行定量建模；以及全面的安全性評估，包括基因毒性和插入風險，即使對于非整合mRNA平臺，也要強有力地排除意外的核遞送或脫靶基因組修飾。

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五、mRNA-CAR-T的挑戰與局限

特異性和脫靶：實現足夠的細胞特異性可以說是體內mRNA-CAR-T療法的核心挑戰。當前的T細胞靶向LNPs顯示出明顯的優先被T淋巴細胞攝取，但它們始終不同程度地轉染非靶細胞。肝細胞、專業抗原呈遞細胞、自然殺傷細胞和其他先天免疫細胞可以通過Fc受體結合、非特異性內吞攝取來內化靶向LNPs。不過，mRNA表達的瞬時性限制了此類脫靶效應與整合載體相比的持久性。一個額外的擔憂是CAR表達于調節性T細胞，這可能減弱抗腫瘤免疫。為了解決這些問題，正在探索多種策略以將體內轉染偏向細胞毒性CD8? T細胞，遠離抑制性T細胞亞群。

LNPs和mRNA的免疫原性：盡管進行了廣泛的核苷修飾，mRNA-LNP仍持續與先天免疫傳感器相互作用，包括不依賴于TLR的胞質RNA受體如RIG-I和MDA5，以及NLRP3炎癥小體。由于CAR表達來自mRNA是瞬時的，大多數體內平臺需要重復給藥，這引發了對累積炎癥毒性和隨著時間推移產生抗LNP免疫的擔憂。

制造與可擴展性：盡管體內mRNA-CAR-T療法避免了患者特異性細胞制造，但它引入了在RNA和納米顆粒生產層面的不同復雜性。生成高質量、GMP級mRNA通常涉及從線性化質粒DNA模板進行體外轉錄，然后是純化以去除雙鏈RNA污染物，摻入修飾核苷，以及嚴格的質量控制以確認序列身份、帽完整性、poly(A)尾長度以及不存在殘留DNA。臨床規模LNP制造需要精確、可擴展的混合技術如微流體系統，嚴格控制粒徑和多分散性，優化包封效率，以及在整個產品生命周期中對穩定性和效力進行全面表征。

腫瘤微環境障礙：免疫抑制性腫瘤微環境（TME）仍然是體內生成的CAR-T細胞的主要障礙，這與體外產品面臨的挑戰相似。來自全身LNP遞送的CAR-T細胞必須在以PD-1/PD-L1檢查點參與、TGF-β驅動的耗竭、以及與腫瘤和基質細胞的激烈代謝競爭為特征的環境中發揮作用。這些因素共同限制了CAR-T細胞在實體瘤中的浸潤、存活和細胞毒性。因此，聯合策略正在成為體內mRNA-CAR-T平臺的一個關鍵焦點。

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結語

體內 mRNA-CAR-T 細胞療法正處于科學概念與臨床現實之間的真正轉折點。在這種新興模式中，脂質納米顆粒工程、精準免疫細胞靶向、合成生物學和 mRNA 治療學的進展正在匯聚，將患者自己的身體轉變為 CAR-T 制造生物反應器，消除了白細胞分離術、體外處理和整合病毒載體的需求。

這種真正現貨型、可快速制造且固有自限性的細胞療法，可作為一劑RNA-LNP小瓶遞送，幾乎可以施用于任何符合條件的患者，無論年齡、前期治療強度或物流可及性如何。這樣的轉變不僅將拓寬基于CAR的干預措施在腫瘤學、自身免疫以及纖維化或感染性疾病中的覆蓋范圍，而且將從根本上改變個性化免疫治療的經濟學和可擴展性。隨著第一批體內mRNA-CAR-T試驗的成熟，使用非病毒核酸技術直接在患者體內編程免疫細胞的更廣泛的體內合成免疫學范式，似乎有望成為未來十年免疫腫瘤學和免疫調節療法中的決定性力量。

參考資料：

In Vivo mRNA-Lipid Nanoparticle CAR-T Cell Engineering: Advances, Challenges, and Clinical Translation. Biomedicines. 2026 Jun 3;14(6):1276.