重磅！從一條“不該存在”的RNA， 到走進臨床的乙肝新指標(biāo)-----世界肝炎日寫下血清HBV RNA發(fā)現(xiàn)、驗證與轉(zhuǎn)化的一段親歷

十年前，我們想回答的是：為什么CHB患者血清中會有HBV RNA？今天，我們還想追問：當(dāng)HBV DNA已經(jīng)檢測不到時，病毒真的沉默了嗎？

寫在第十六個世界肝炎日

● 2010年5月，第63屆世界衛(wèi)生大會通過WHA63.18號決議，將每年7月28日確定為世界肝炎日；2011年7月28日，世界衛(wèi)生組織首次按這一決議舉辦世界肝炎日活動。今年是第十六個世界肝炎日。

選擇7月28日，是為了紀念乙型肝炎研究先驅(qū)巴魯克·塞繆爾·布隆伯格教授。他發(fā)現(xiàn)了后來被稱為乙肝表面抗原的“澳大利亞抗原”，推動建立乙肝檢測并開發(fā)疫苗，改變了無數(shù)人的命運。

中國曾經(jīng)是肝炎大國。經(jīng)過數(shù)十年的疫苗接種、母嬰阻斷和抗病毒治療，我國乙肝防控取得了舉世矚目的進步；但乙肝造成的肝硬化和肝細胞癌負擔(dān)仍然沉重。世界肝炎日談“消除肝炎”，既要回望疫苗和抗病毒藥物帶來的改變，也應(yīng)記錄中國研究者為乙肝診斷和治療作出的探索。

我想借這個日子，回顧我們與許多同行共同推動的一項工作：血清HBV RNA——一條按照經(jīng)典教科書似乎“不該大量存在”于血液中的病毒RNA，如何被重新認識，進而成為一個走進臨床的乙肝新指標(biāo)。

一條“不該存在”的RNA

● HBV是一種DNA病毒，但它的復(fù)制必須經(jīng)過RNA中間體。肝細胞核內(nèi)的共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生前基因組RNA（pgRNA）；pgRNA與病毒聚合酶結(jié)合后被包裝進核心蛋白形成的核衣殼，并在其中逆轉(zhuǎn)錄生成HBV DNA。成熟的含DNA核衣殼獲得包膜后釋放入血，成為我們熟悉的丹顆粒。

照此理解，在感染肝細胞的細胞質(zhì)內(nèi)，核衣殼首先將pgRNA/pol蛋白復(fù)合物包裹起來，然后啟動逆轉(zhuǎn)錄過程（注：有人將之等同于存在于循環(huán)血的pgRNA病毒樣顆粒，使錯誤的理解）；進入血液的完整病毒顆粒（Dane顆粒）應(yīng)當(dāng)主要攜帶rcDNA。然而，早在1996年，Kock等就已在慢性HBV感染者血清中檢測到多聚腺苷化的HBV RNA。此后相當(dāng)長時間里，一個基本問題始終沒有得到令人信服的回答：血清中的HBV RNA究竟是什么？它是細胞破裂后泄漏的游離RNA、外泌體攜帶的片段，還是病毒顆粒形成過程中產(chǎn)生的某種產(chǎn)物？

這個問題在接受核苷（酸）類似物（NAs）治療的患者中尤其值得關(guān)注。NAs強力抑制逆轉(zhuǎn)錄，往往能很快使血清HBV DNA降至檢測下限以下；但不少患者的血清HBV RNA依然存在。這些RNA為何沒有隨著DNA一起消失？

2016年，我們確認了它的“身份”

● 緣起：下一個五年，我們做什么？

●“十三五”國家科技重大專項即將啟動之際，我曾把實驗室的主要助手和合作者召集到一起，討論了一個頗為“嚴肅”的問題：下一個五年，我們做什么？

“十一五”期間，我們承擔(dān)的乙肝、丙肝診斷試劑研發(fā)，實現(xiàn)了相關(guān)檢測從定性向定量的轉(zhuǎn)變；“十二五”期間，我們以病毒性肝炎診斷試劑研發(fā)及其臨床意義為主線，聯(lián)合大學(xué)、科研機構(gòu)、醫(yī)院，特別是診斷試劑企業(yè)，推動已有試劑質(zhì)量提升，并探索新型定量指標(biāo)的臨床應(yīng)用。那么，到了“十三五”，還只是把現(xiàn)有試劑做得更好嗎？

大家最終形成的共識是：下一步應(yīng)當(dāng)轉(zhuǎn)向新指標(biāo)的發(fā)現(xiàn)、臨床價值驗證和診斷試劑轉(zhuǎn)化。對我們實驗室而言，其中一個重點就是血清HBV RNA：厘清它的分子組成和存在形式，判斷它能否成為一種新的血清病毒學(xué)指標(biāo)，驗證其臨床意義，并最終推動臨床檢測試劑研發(fā)，使其服務(wù)于患者的診療。要實現(xiàn)這些目標(biāo)，首先必須回答一個最基本的問題：血清中的HBV RNA究竟是什么？

經(jīng)過一系列核酸酶消化、密度梯度離心、免疫沉淀、電子顯微鏡觀察和分子結(jié)構(gòu)分析，我們在2016年發(fā)表于《Journal of Hepatology》的研究中證實：CHB患者血清HBV RNA的主體，是存在于丹顆粒樣病毒顆粒核衣殼內(nèi)的pgRNA及其逆轉(zhuǎn)錄殘余。這些RNA并不是簡單漂浮于血液中的轉(zhuǎn)錄碎片，而是經(jīng)過包裝和顆粒裝配后釋放入血的病毒復(fù)制產(chǎn)物。

這項發(fā)現(xiàn)也補充了我們對HBV生命周期的認識。聚合酶抑制劑阻斷了pgRNA向DNA的逆轉(zhuǎn)錄，卻并不直接關(guān)閉cccDNA轉(zhuǎn)錄，更不阻止含RNA核衣殼的形成和釋放。因此，在NAs治療下，HBV DNA可以迅速下降，而血清pgRNA仍可能持續(xù)存在。

血清HBV RNA陽性所代表的，不只是“測到了一段RNA”，而是肝內(nèi)仍可能存在cccDNA轉(zhuǎn)錄、病毒蛋白翻譯及核衣殼裝配。

由于pgRNA顆粒的形成需要病毒聚合酶與pgRNA結(jié)合，也需要核心蛋白表達并完成核衣殼裝配，血清中仍可檢出這類顆粒，至少提示肝細胞內(nèi)病毒轉(zhuǎn)錄和部分蛋白表達尚未停止。core、polymerase等病毒抗原仍可能成為免疫識別的對象，為持續(xù)的免疫介導(dǎo)炎癥提供生物學(xué)基礎(chǔ)。當(dāng)然，血清HBV RNA目前首先是殘余病毒活動的標(biāo)志物；它本身是否直接驅(qū)動肝臟炎癥、纖維化或腫瘤發(fā)生，仍不能由相關(guān)性研究簡單下結(jié)論。

一次由審稿意見推動的多中心驗證

● 這篇文章的臨床部分，還源于投稿過程中的一次重要推動。審稿人提出：僅僅證明血清HBV RNA是什么還不夠。為了更好地驗證它的臨床意義，特別是能否識別NAs停藥后發(fā)生病毒學(xué)反彈和復(fù)發(fā)的高風(fēng)險患者，需要進一步的不同地域的多中心隊列研究。

在當(dāng)時有限的時間里，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院高志良教授團隊和重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院任紅教授團隊給予了大力支持，使我們得以完成多中心臨床驗證。結(jié)果顯示，在停藥時HBV DNA均已檢測不到的患者中，血清HBV RNA仍為陽性者，停藥后發(fā)生病毒學(xué)反彈的風(fēng)險顯著更高；相反，HBV DNA和HBV RNA持續(xù)雙陰性的患者，復(fù)發(fā)風(fēng)險明顯較低。

多年以后回望，我仍十分感謝審稿人的這一追問，也感謝高志良教授、任紅教授及其團隊在關(guān)鍵時刻伸出的援手。正是這次合作，使一項關(guān)于“血清中究竟存在什么”的病毒學(xué)發(fā)現(xiàn)，從一開始就與“它能為患者帶來什么”聯(lián)系在了一起。

從“它是什么”走向“它能告訴臨床什么”

● 隨后，不同實驗室——也包括我們——從多個角度證實，血清HBV RNA與肝內(nèi)cccDNA轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)，而且這種聯(lián)系并不會因為NAs治療而消失。HBV DNA主要反映逆轉(zhuǎn)錄的結(jié)果；在逆轉(zhuǎn)錄受到藥物強力抑制后，血清HBV RNA則為觀察殘余cccDNA轉(zhuǎn)錄活動打開了另一扇窗口。

隨著研究積累，血清HBV RNA被用于探索多個臨床問題：預(yù)測NAs停藥后的病毒學(xué)反彈和臨床復(fù)發(fā)，評價長期治療中的殘余病毒活動，預(yù)測HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，以及作為乙肝新藥臨床試驗中的探索性病毒學(xué)終點。從2017年寫入EASL更新指南開始，它又陸續(xù)進入我國慢性乙肝防治指南、亞太肝病學(xué)會停藥指導(dǎo)意見、EASL-AASLD治療終點專家會議報告以及FDA乙肝新藥研發(fā)指導(dǎo)建議等文件。

在推動血清HBV RNA走向臨床應(yīng)用的過程中，南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院孫劍/侯金林教授及其團隊開展了一系列系統(tǒng)研究，涉及NAs治療應(yīng)答、停藥后復(fù)發(fā)、不同檢測靶區(qū)的方法學(xué)差異以及遠期HCC風(fēng)險。其中，2025年發(fā)表于《Clinical Gastroenterology and Hepatology》的一項多中心回顧-前瞻性隊列研究納入1,374例接受恩替卡韋或替諾福韋治療的CHB患者。結(jié)果顯示，治療第1年和第2年血清HBV RNA下降不足，均與更高的HCC發(fā)生風(fēng)險獨立相關(guān)；將早期HBV RNA下降幅度納入PAGE-B、mPAGE-B和aMAP等既有風(fēng)險模型后，還可進一步提高其預(yù)測效能。這項研究把血清HBV RNA的臨床意義，從反映殘余病毒轉(zhuǎn)錄活性和預(yù)測停藥復(fù)發(fā)，推進到了NA治療下長期HCC風(fēng)險分層。

臨床組織學(xué)研究進一步賦予了這個指標(biāo)更具體的意義。北京友誼醫(yī)院尤紅、賈繼東團隊聯(lián)合華山醫(yī)院張文宏團隊及我們實驗室，對239例具有治療前后配對肝活檢的CHB患者進行了研究。即使經(jīng)過78周抗病毒治療，部分患者血清中僅殘留20–200 IU/mL的低水平HBV DNA，其可檢出仍與肝纖維化進展獨立相關(guān)；與此同時，纖維化逆轉(zhuǎn)患者的血清HBV RNA下降幅度明顯大于纖維化進展患者。

這項合作讓我進一步看到：殘余HBV DNA或HBV RNA并非無關(guān)緊要的“分子尾跡”，而可能是肝內(nèi)病毒活動尚未完全沉寂、并影響組織學(xué)恢復(fù)的外周標(biāo)志。此后，也有研究發(fā)現(xiàn)，在接受NAs治療的CHB患者中，較高或持續(xù)可檢出的血清HBV RNA與更高的HCC發(fā)生風(fēng)險相關(guān)；在HBV DNA已不可檢出的HBV相關(guān)HCC患者中，較高的血清pgRNA還與術(shù)后復(fù)發(fā)和不良預(yù)后相關(guān)。這里仍需強調(diào)：這些研究支持的是風(fēng)險標(biāo)志物價值，并不等于證明HBV RNA顆粒本身直接導(dǎo)致纖維化或HCC。

一個新指標(biāo)走向臨床，并非一帆風(fēng)順

● 科學(xué)發(fā)現(xiàn)要進入臨床，遠不只是發(fā)表一篇論文。早期我們圍繞血清HBV RNA檢測先后申請了系列專利，并授權(quán)企業(yè)開發(fā)相應(yīng)試劑。但這一指標(biāo)的臨床應(yīng)用價值也曾受到一些質(zhì)疑，相關(guān)研發(fā)工作一度受到影響。

在國家“十三五”傳染病防治重大專項執(zhí)行期間，了解到有關(guān)情況后，我推動調(diào)整研發(fā)的安排，由新的項目主體承擔(dān)單位去主力完成。最終，在熱景生物高琦博士領(lǐng)導(dǎo)的研發(fā)團隊成員的共同堅持和努力下，檢測體系得以完成（注：期間我曾參觀過今天已經(jīng)是高博士的工位，抬頭可見處就是一個軍令狀，詳細地列出了關(guān)鍵??節(jié)點要達成的主要指標(biāo)，及對應(yīng)的獎懲措施）。此后，由熱景生物和圣湘生物分別研發(fā)的相關(guān)檢測試劑陸續(xù)獲批并進入臨床應(yīng)用。北大作為相關(guān)專利的擁有者和我作為項目的親歷參與者，在這里也作一項利益關(guān)系說明。我們牽頭的該課題，后來增補了的另一任務(wù)承擔(dān)單位上海仁度生物，由其開發(fā)的恒溫擴增檢測試劑也已獲批。

一個新指標(biāo)當(dāng)然可以、也應(yīng)該被質(zhì)疑。只有經(jīng)得起“為什么要測、測到的是什么、能否改善臨床診斷和有助于對患者的評估與管理并使之獲益”的連續(xù)追問，它才可能從一項有趣的發(fā)現(xiàn)成長為真正有用的臨床工具。但是否值得繼續(xù)驗證，最終應(yīng)該由嚴謹?shù)膶嶒灐⑴R床隊列和患者結(jié)局來回答。

與國際診斷企業(yè)交流留下的不同記憶

● 在試劑研發(fā)早期，我們曾與Roche和Abbott就血清HBV RNA進行交流。后來，Roche還曾提供50萬元人民幣研究經(jīng)費，支持我們開展HBV cccDNA基礎(chǔ)研究。兩件事之間是否存在直接聯(lián)系，我并不清楚，但這份對基礎(chǔ)研究的支持，至今仍值得感謝。

兩家公司后來都開展了血清HBV RNA檢測研發(fā)，但迄今主要仍作為科研試劑使用。后來看到Abbott選擇了與我們不同的檢測區(qū)域，我曾猜想，這或許有繞開既有專利的考慮。當(dāng)然，這只是作為親歷者的一種推測。更值得討論的科學(xué)問題和臨床應(yīng)用考慮是，不同靶區(qū)選擇可能帶來真實的生物學(xué)差異：作為逆轉(zhuǎn)錄模板的pgRNA，其3′端更容易發(fā)生降解和截短，因此，不同檢測體系所看到的“血清HBV RNA”，可能并不是完全相同的一組分子。檢測標(biāo)準(zhǔn)化至今仍是這一領(lǐng)域需要認真解決的問題。

從第一版共識到第二版：指標(biāo)的“身份”正在改變

● 2022年，中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與實驗診斷協(xié)作組組織制定了第一版《慢性HBV感染者血清HBV RNA檢測及臨床應(yīng)用的專家共識》，對檢測方法、結(jié)果解釋和臨床應(yīng)用場景進行了系統(tǒng)梳理。

目前，第二版共識正在撰寫。與第一版不同，這一次改由中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會組織，主要由臨床醫(yī)生參與和主導(dǎo)，并由孫劍教授和中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會前任主委也是第二版共識的主要發(fā)起者徐小元教授共同擔(dān)當(dāng)。起草主體的變化，看似只是組織形式的調(diào)整，背后反映的卻是血清HBV RNA正在從一個由基礎(chǔ)研究和實驗室診斷推動的新指標(biāo)，逐漸成為臨床醫(yī)生主動關(guān)注、評價和規(guī)范使用的工具。

作為這一指標(biāo)早期發(fā)現(xiàn)、實驗驗證和臨床轉(zhuǎn)化的親歷者，看到這樣的變化，我確實有一點小小的自豪。一個新指標(biāo)真正得到認可，不只是被寫進了多少個指南或共識，更重要的是臨床醫(yī)生開始主動討論：它能幫助我們解決什么問題，又能否改變患者的評估與管理。

下一步：從HBV DNA、HBV RNA走向病毒總核酸

● 早在血清pgRNA檢測研發(fā)過程中，我們就提出了同時檢測HBV DNA和RNA、以血清病毒總核酸評價殘余病毒活動的設(shè)想，并建立了相應(yīng)檢測體系和方法。近年來，這一項目得到中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展專項支持，目前體系建設(shè)已基本完成。

為什么還要檢測“總核酸”？在NAs治療下，HBV DNA常被壓低至現(xiàn)有高靈敏度試劑的檢測下限以下，但此時HBV RNA仍可能持續(xù)存在。初步臨床隊列比較顯示，由于檢測靶標(biāo)增加了HBV RNA，總核酸檢測相對于公認性能優(yōu)異的HBV DNA檢測試劑，能夠進一步提高殘余病毒核酸的檢出能力；這一優(yōu)勢在接受NAs治療、HBV DNA已極低或不可檢出的患者中尤其明顯。

這種“更靈敏”不只是分析性能上的數(shù)字改進。若總核酸陽性來自被核衣殼包裹的HBV DNA、和pgRNA及其殘余，它提示的可能不僅是還有核酸存在，也包括肝內(nèi)仍在發(fā)生病毒轉(zhuǎn)錄、部分蛋白翻譯和顆粒裝配。它們能否更準(zhǔn)確地反映殘余cccDNA轉(zhuǎn)錄活性，能否預(yù)測NA停藥后的病毒學(xué)反彈，能否評價乙肝新藥對不同生命周期環(huán)節(jié)的作用深度，以及能否幫助我們識別傳統(tǒng)HBV DNA檢測已經(jīng)“看不見”、但病毒活動尚未完全沉寂的患者，正是下一階段需要回答的問題。

寫在最后：一份小小的自豪，也是一份繼續(xù)求證的責(zé)任

● 回望這段經(jīng)歷，我最想感謝的，是那些在研究最需要臨床隊列、組織學(xué)證據(jù)和研發(fā)力量時伸出援手的同行與合作者。一個新指標(biāo)從實驗室走向臨床，從來不是一個人的工作，也不是一篇論文能夠完成的。審稿人的追問、高志良教授和任紅教授團隊在多中心驗證中的支持，尤紅教授、賈繼東教授、張文宏教授團隊在組織學(xué)研究中開創(chuàng)性的工作及我們間的合作，以及高琦博士和研發(fā)團隊在轉(zhuǎn)化階段的堅持，更重要的還有來自科技重大專項的對“好課題”的追加支持，共同構(gòu)成了這條道路。

中國曾經(jīng)是肝炎大國，今天乙肝造成的疾病負擔(dān)仍然十分沉重。在乙肝實驗室診斷指標(biāo)中，血清HBV RNA可能是少數(shù)從病毒學(xué)發(fā)現(xiàn)、實驗驗證、臨床評價到檢測試劑轉(zhuǎn)化，主要由中國學(xué)者和中國企業(yè)推動完成的新指標(biāo)。它當(dāng)然還不完美，其檢測標(biāo)準(zhǔn)化和臨床應(yīng)用邊界仍需更多研究回答；但也正因如此，這段歷史值得被如實記錄。

從基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與實驗診斷協(xié)作組起草第一版共識，到由肝病學(xué)分會和臨床醫(yī)生主導(dǎo)的即將發(fā)表的第二版；從一條“不該存在”的RNA，到獲批進入臨床的乙肝新指標(biāo)——它走過的，正是一項主要由中國學(xué)者推動的新指標(biāo)逐漸被臨床認識和接納的道路。

HBV DNA陰性回答的是逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是否仍然可見；HBV總核酸檢測進一步追問的，則是肝內(nèi)病毒的轉(zhuǎn)錄、蛋白表達和顆粒裝配是否仍在繼續(xù)，以及這些殘余活動是否仍在影響患者的肝臟結(jié)局。

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