Cell Rep |?馬軍團隊揭示猴痘病毒DNA復制關鍵元件I3L的雙環組裝和DNA結合機制

近日，深圳灣實驗室傳染病研究所馬軍課題組在Cell Reports發表題為Double-ring assembly of mpox virus I3L reveals an unconventional mechanism for ssDNA engagement的研究論文。該研究利用冷凍電鏡（Cryo-EM）單顆粒分析技術，解析了猴痘病毒（MPXV）DNA復制關鍵組分——單鏈DNA結合蛋白（single-strand DNA binding protein, SSB）I3L的冷凍電鏡結構。結構信息結合生化實驗，研究揭示了I3L的OB-fold變體單體構架、獨特的雙環組裝模式、新穎的ssDNA結合模式以及長度依賴性的DNA結合機制，為靶向抗猴痘病毒的藥物理性設計提供了重要結構基礎。

猴痘病毒（Mpox virus, MPXV）是一種正痘病毒屬的雙鏈DNA病毒，具有高度傳染性，可導致人類出現嚴重皮膚病變、發熱及淋巴結腫大等臨床癥狀。近年來，猴痘疫情在全球多國快速蔓延，世界衛生組織曾兩次宣布其構成“國際關注的突發公共衛生事件”（PHEIC），全球累計確診病例已超15萬例，對國際公共衛生安全帶來了極大的常態化防控挑戰。目前，臨床上仍極度缺乏針對猴痘病毒的高效特異性疫苗或獲批的臨床特效抗病毒藥物。痘病毒的DNA復制在細胞中質特化形成的“病毒工廠”內獨立進行，高度依賴于病毒自身編碼的五種核心復制蛋白構建的精密復制機器。在痘苗病毒中，DNA復制主要由異三聚體DNA聚合酶全酶（E9L-A20R-D4R）、引物酶-解旋酶（D5R）以及單鏈DNA結合蛋白I3L執行；在猴痘病毒中，對應蛋白分別為F8L-A22R-E4R、E5R和I3L。其中，單鏈DNA結合蛋白I3L不僅能保護暴露的單鏈DNA免受核酸酶降解，還作為病毒復制和重組機器的中心樞紐，與多種病毒和宿主蛋白相互作用，發揮關鍵作用。近年來，痘病毒其他幾種核心復制蛋白的結構均已被相繼解析。然而，盡管I3L對病毒復制至關重要，但其高分辨率結構信息此前仍處于空白，導致I3L發揮功能的分子機制尚不清楚，這也在一定程度上限制了對痘病毒基因組復制與調控機制的全面理解。

核心研究亮點

1. 揭示獨特的雙環組裝結構

單鏈DNA結合蛋白（SSB）在幾乎所有生物的DNA代謝、復制與保護中都發揮著必不可少的作用。目前已知結構的單蛋白型SSB中，經典的細菌和線粒體SSB以四聚體的形式發揮功能，而部分噬菌體和非洲豬瘟的SSB為單體。研究團隊通過在大腸桿菌和昆蟲細胞兩種表達系統中優化I3L的表達克隆及截短體設計，并精心優化冷凍電鏡樣品制備條件，利用cryo-EM成功解析了猴痘病毒I3L與單鏈DNA（ssDNA）復合物的高分辨率結構（分辨率達3.6 ?）。令人意外的是，I3L蛋白并非以常規的四聚體形式存在，而是組裝成一種此前未見報道的雙層環狀結構（Double-ring）。每個單層環由6–10個I3L亞基組成，以八亞基為主導，兩個環面對面堆疊形成穩定的雙環復合物。這一獨特的雙環組裝方式，為SSB蛋白家族增添了全新的結構類型。

2. 闡明I3L蛋白單體獨特的OB-fold變體構架

結構分析顯示，猴痘病毒I3L單體與經典的OB-fold結構域具有較高相似性，其中與非洲豬瘟病毒CP312R等病毒SSB的結構同源性最高。然而，I3L在保留OB-fold核心結構域的基礎上，在外周區域進化出多個特異性結構元件，形成了一種新型OB-fold變體。研究團隊將其單體形態形象地比喻為一把“長嘴澆花壺”：經典的OB-fold-like核心構成“壺身”（Core），輔助結構域形成“壺蓋”（Lid）和“把手”，C端延伸的β折疊片則形成特殊的“長壺嘴”（P-tail）?；谶@一獨特構架，I3L采用了一種新穎的“循環尾部插入”（Cyclic tail-insertion）機制，也稱為“銜尾蛇”（Ouroboros motif）組裝模式：一個單體的P-tail插入相鄰單體的OB-fold結構域，循環重復形成閉合的雙環結構。與其他SSB相比，I3L既保留了經典的DNA結合特征，又發展出專有結構元件，體現了痘病毒在細胞質環境中對單鏈結合蛋白進行的精細功能優化和空間適應。

3. I3L 獨特的ssDNA結合模式和協同結合效應

結構分析顯示，組裝成型的I3L雙環結構中心形成了一條貫穿的正電荷內部通道。在I3L–ssDNA復合物的 cryo-EM密度圖中，觀察到除蛋白質外的額外密度，推測為ssDNA，但其密度質量尚不足以構建原子模型。結合AlphaFold 3結構預測、生物膜干涉技術（BLI）和凝膠電泳遷移率阻滯實驗（EMSA）等體外生化實驗，研究系統闡明了參與ssDNA結合的關鍵氨基酸殘基及其作用。此外，研究發現I3L對ssDNA的結合呈現典型的“長度依賴性協同效應”：單體形式的結合親和力隨DNA長度增加僅溫和提升，而雙環復合物則表現出顯著的協同效應。其機制可能在于較長DNA可同時占據多個結合位點，降低解離速率并促進鄰近亞基的募集，形成“拉鏈式”結合。值得注意的是，單環突變體的親和力反而更高，這可能與通道暴露相關，進一步凸顯了寡聚化狀態與 DNA長度在 I3L 功能中的協同作用。綜上，I3L通過“空間包裹+協同捕獲”的雙重機制，將ssDNA牢牢包裹在雙環內部的正電荷通道中，在物理上阻斷宿主核酸酶的降解，為病毒基因組的高效復制與維持提供核心保護。這一“裝配依賴性”的核酸結合模式顯著不同于經典細菌SSB（如 EcSSB以四聚體形式在外周纏繞 DNA）或真核CST復合物，代表了一種獨特的“空間包裹”結合策略，為理解正痘病毒屬的基因組維持與復制機制提供了全新視角。

本研究通過冷凍電鏡結構解析，并結合生化與相互作用驗證，揭示了猴痘病毒單鏈DNA結合蛋白I3L通過特異性雙環組裝實現基因組保護與協同復制的分子機制，補齊了猴痘病毒DNA復制機器結構生物學研究的“最后一塊核心拼圖”，顯著深化了對正痘病毒DNA復制機制的理解，也為抗病毒藥物研發提供了新思路。由于人類宿主細胞內的相似單鏈結合蛋白（如mtSSB和RPA）在結構和組裝模式上與I3L存在顯著差異，I3L成為了一個極具吸引力且低脫靶風險的抗病毒藥物靶點。未來，可通過設計特異性小分子或多肽，靶向破壞I3L的雙環組裝或阻斷其內部DNA結合通道，從而高效抑制病毒復制。

深圳灣實驗室特聘研究員馬軍和安徽農業大學動物醫學院副教授王勇為本論文通訊作者；助理研究員楊侃侃、研究助理蓋夢蕊、宋金妙及鄒俊偉為本文的共同第一作者。冷凍電鏡數據采集工作在深圳醫學科學院（SMART）結構生物學平臺完成。

原文鏈接：https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(26)00737-0

制版人： 十一

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