江南大學(xué)周志/廈門大學(xué)王斌舉Nat Commun｜人工酶的細(xì)胞內(nèi)高效組裝及體內(nèi)非天然不對稱生物合成

導(dǎo)讀

通過將非催化輔因子引入蛋白質(zhì)骨架而構(gòu)建的人工酶，正逐漸成為針對非天然反應(yīng)的極具前景的生物催化劑。然而，由于復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境帶來了諸多挑戰(zhàn)，開發(fā)細(xì)胞內(nèi)人工酶的構(gòu)建策略及非天然催化功能具有較大的挑戰(zhàn)，特別是在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行立體選擇性生物合成的人工酶研究報(bào)道十分有限。因此，如何在細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建含有非天然催化中心的人工酶并在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)其非天然不對稱催化功能是當(dāng)前面臨的關(guān)鍵科學(xué)問題。近日，江南大學(xué)周志教授組聯(lián)合廈門大學(xué)王斌舉教授組在知名期刊Nature Communications上發(fā)表了題為“Intracellular assembly of artificial enzymes for cytoplasmic enantioselective Mannich reactions”的研究論文。該研究報(bào)道了一種基于蛋白與非天然催化輔因子共價(jià)修飾的人工酶細(xì)胞內(nèi)高效構(gòu)建策略。僅需將表達(dá)目標(biāo)蛋白的細(xì)胞與人工輔因子進(jìn)行短時(shí)間孵育，可實(shí)現(xiàn)含非天然催化中心人工酶的快速高效組裝。體內(nèi)成功組裝的人工酶可高效催化一例不對稱曼尼希反應(yīng)，并在細(xì)胞內(nèi)和體外高效合成非天然手性β-氨基酮。利用該策略，可通過全細(xì)胞催化循環(huán)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)非天然手性含氮化合物的克級生產(chǎn)，從而展示了其在非天然生物合成中的應(yīng)用潛力。這項(xiàng)工作建立了一種簡單且具有普適性的人工酶體內(nèi)構(gòu)建方法，可利用多種生物支架和合成輔因子，在細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建具有新型功能的人工酶，從而擴(kuò)展了在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行定制化合成應(yīng)用的生物酶元件庫。

人工酶的設(shè)計(jì)與工程化代表了生物催化領(lǐng)域的一個(gè)變革性前沿，它融合了蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)、化學(xué)生物學(xué)、有機(jī)合成和定向進(jìn)化的原理，以擴(kuò)展自然界分子機(jī)器的催化能力。盡管在設(shè)計(jì)具有定制化體外反應(yīng)性的人工酶方面已取得顯著進(jìn)展，但將這些系統(tǒng)應(yīng)用于活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行多樣化的非生物轉(zhuǎn)化仍是一項(xiàng)艱巨的挑戰(zhàn)，特別是對于需要嚴(yán)格立體控制的不對稱轉(zhuǎn)化而言。在細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建人工酶面臨的一個(gè)核心挑戰(zhàn)，是如何將非生物催化輔因子高效且位點(diǎn)特異性地嵌入蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)空腔中。在體外，通常采用共價(jià)鍵、供體和超分子策略，為蛋白質(zhì)支架賦予非天然催化位點(diǎn)。然而，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境帶來了額外的復(fù)雜性，因?yàn)楦偁幮缘挠H核試劑、氧化還原過程以及蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)網(wǎng)絡(luò)可能會影響輔因子的穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)的折疊以及催化性能。

早期研究主要側(cè)重于利用親和錨定技術(shù)在細(xì)胞內(nèi)組裝人工金屬酶（ArMs），以最大限度地減少細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的影響。將非天然氨基酸納入酶設(shè)計(jì)，是構(gòu)建細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)人工酶的一種極具前景的策略。然而，工程化酶表達(dá)水平低、細(xì)胞內(nèi)立體選擇性受限以及催化活性下降等挑戰(zhàn)很大程度上限制了該方法的應(yīng)用范圍。在細(xì)胞內(nèi)設(shè)計(jì)人工酶時(shí)，共價(jià)修飾方法少有探索，因?yàn)楣矁r(jià)修飾方法通常需要在純化的酶。然而，在簡便性和通用性方面，共價(jià)策略具有明顯的優(yōu)勢。將其應(yīng)用于人工酶的高效細(xì)胞內(nèi)組裝，可大幅拓寬可用于全細(xì)胞生物催化的酶類和催化反應(yīng)的多樣性。本文報(bào)道了一種通過共價(jià)錨定實(shí)現(xiàn)人工酶的細(xì)胞內(nèi)組裝的高效策略，與天然酶類似的方式，通過向攜帶多種蛋白質(zhì)骨架的細(xì)胞中直接添加合成催化輔因子孵育，人工酶通過在細(xì)胞內(nèi)與人工仲胺輔因子高效地形成共價(jià)二硫鍵構(gòu)建而成，整個(gè)過程簡單高效。

圖1 人工酶的細(xì)胞內(nèi)組裝及非天然催化反應(yīng)

先前作者曾報(bào)道過通過二硫鍵交換，將催化性仲胺輔因子（SA）共價(jià)嵌入純化的 LmrR骨架口袋中，從而在體外構(gòu)建了人工邁克爾酶 LmrR_SA。作者將攜帶 LmrR_Cys 蛋白的大腸桿菌與不同濃度的合成輔因子SA及不同反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行孵育，研究合成輔因子 SA 與目標(biāo)生物支架 LmrR 在細(xì)胞內(nèi)的生物偶聯(lián)效率，并發(fā)現(xiàn)細(xì)胞與合成輔因子SA孵育僅10分鐘即可在細(xì)胞內(nèi)高效構(gòu)建完成目標(biāo)人工酶。此后，作者設(shè)置環(huán)己酮與環(huán)狀亞胺的Mannich反應(yīng)為模板反應(yīng)并使用細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建的人工酶進(jìn)行活性測試，攜帶蛋白LmrR_L57C_N88A的大腸桿菌的參與全細(xì)胞反應(yīng)的初始活性與立體選擇性最高（58% e.e.，9:1 d.r., 58% 產(chǎn)率），空白對照組證明目標(biāo)蛋白與輔因子對高立體選擇性的反應(yīng)缺一不可。在測試其他蛋白骨架（Myoglobin，Nitrobindin）與純酶活性驗(yàn)證后，作者確定LmrR_L57C_N88A_SA1（AM_57SA_2.0）為最佳起始蛋白以獲得目標(biāo)產(chǎn)物(R, S)-3a（73% e.e.，10:1 d.r., 98% 產(chǎn)率）。

圖2 人工酶的體內(nèi)和體外構(gòu)建及催化的不對稱反應(yīng)

為進(jìn)一步提高反應(yīng)立體選擇性，作者基于粗酶的篩選策略進(jìn)行了定向進(jìn)化，并驗(yàn)證合成的輔因子SA無需像傳統(tǒng)共價(jià)人工酶進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理，可類似于天然輔因子磷酸吡哆醛（PLP）和硫胺素焦磷酸（ThDP）等，直接向粗酶液中加入如即可在反應(yīng)體系中有效發(fā)揮作用。在經(jīng)過三輪定向進(jìn)化后，獲得最優(yōu)變體AM_57SA_5.0（96% e.e.，>20:1 d.r., >99% 產(chǎn)率），其催化效率約為(kcat/KM(imine))為AM_57SA_1.0的1.7倍，并且在全細(xì)胞反應(yīng)條件下，反應(yīng)保持了較好的立體選擇性（90% e.e.，>20:1 d.r., >99%產(chǎn)率）。

圖3 人工酶的定向進(jìn)化

在確定了最優(yōu)條件并獲得了進(jìn)化突變體后，我們分別在細(xì)胞內(nèi)和體外條件下，研究了進(jìn)化突變體AM_57SA_5.0介導(dǎo)的曼尼希反應(yīng)的底物范圍（圖4）。環(huán)狀亞胺的兩個(gè)芳香環(huán)上的取代包括甲氧基、鹵素、氰基和空間位阻較大的叔丁基等，無論在細(xì)胞內(nèi)還是體外反應(yīng)中均能被很好地容忍（3a-3s），但全細(xì)胞下的反應(yīng)立體選擇性均略低于純酶反應(yīng)結(jié)果。環(huán)狀酮的結(jié)構(gòu)特征顯著影響反應(yīng)的立體選擇性和反應(yīng)性。與4-氧代硫環(huán)戊烷（3t）和4,4-二甲基環(huán)己酮（3v）的反應(yīng)保持了優(yōu)異的對映體選擇性和收率。

圖 4 人工酶體內(nèi)和體外催化不對稱曼尼希反應(yīng)底物譜考察

作者為驗(yàn)證在全細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)高效構(gòu)建人工酶所采用策略的有效性和實(shí)用性，在全細(xì)胞條件下，通過人工酶對手性曼尼希產(chǎn)物進(jìn)行了半制備和克級制備合成。首先，在OD600=10的條件下，利用攜帶AM_57SA_5.0的大腸桿菌細(xì)胞對6種手性磺酰胺進(jìn)行了半制備級別生物合成（30 mg），且具有良好的立體選擇性。為了進(jìn)一步說明設(shè)計(jì)的細(xì)胞內(nèi)人工酶構(gòu)建策略在非天然產(chǎn)物生物合成中的適用性，作者設(shè)計(jì)了一個(gè)全細(xì)胞催化循環(huán)系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)非天然手性磺酰胺的克級生產(chǎn)，在800 mL體系中進(jìn)行4次循環(huán)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)，最終，分離獲得了1.06 g手性磺酰胺(R, S)-3a，其對映體選擇性為90%，d.r.值>20:1，分離收率達(dá)97%。

圖5 人工酶催化在全細(xì)胞生物合成中的應(yīng)用示范

作者進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)證明該不對稱曼尼希反應(yīng)是否在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的。通過設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證僅含有目的蛋白的菌沉淀具備明顯的催化活性，反應(yīng)中游離輔因子以及可能游離的蛋白對反應(yīng)影響較小。這些實(shí)驗(yàn)表明該不對稱曼尼希反應(yīng)是由細(xì)胞內(nèi)的人工酶而非細(xì)胞外的人工酶催化的。作者通過向全細(xì)胞體系中額外加入輔因子當(dāng)量比的谷胱甘肽，觀察到反應(yīng)立體選擇性與活性下降非常有限，證明全細(xì)胞體系中細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽對催化性能的影響微乎其微，反應(yīng)12小時(shí)后人工酶仍然保持完整二硫鍵結(jié)構(gòu)，表明胞內(nèi)組裝的人工酶具有良好的穩(wěn)定性。

圖6 人工酶細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了理解這些人工曼尼希酶在調(diào)控立體選擇性方面的機(jī)制和關(guān)鍵因素，作者進(jìn)行分子動力學(xué)（MD）模擬和QM/MM計(jì)算。由于兩個(gè)底物之間的C-C偶聯(lián)可能導(dǎo)致產(chǎn)物出現(xiàn)四種立體選擇性（R–R、S–R、S–S、R–S），因此在分子對接和分子動力學(xué)模擬過程中考慮了四種底物結(jié)合構(gòu)象。在此體系中，僅有R–S相關(guān)結(jié)合構(gòu)象的兩種底物能夠維持穩(wěn)定且保持適宜的C1-C2距離（3 ?）。后續(xù)作者基于分子動力學(xué)模擬中確定的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，進(jìn)行了QM/MM計(jì)算以評估C1–C2鍵形成的能壘。反應(yīng)物復(fù)合物 (RC) 的 QM/MM 優(yōu)化結(jié)構(gòu)顯示C1-C2距離為2.96 ?。以RC為起點(diǎn)，QM/MM 計(jì)算表明C1-C2鍵的形成面臨 5.2 kcal/mol 的能量勢壘。值得注意的是，Arg10和Arg56通過形成氫鍵網(wǎng)絡(luò)中的鹽橋相互作用來穩(wěn)定底物，這與突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。將這兩個(gè)殘基均替換為丙氨酸會導(dǎo)致產(chǎn)物收率顯著降低。隨后進(jìn)一步的分子動力學(xué)模擬表明，水分子會進(jìn)入活性位點(diǎn)并促進(jìn)水解反應(yīng)。QM/MM 計(jì)算顯示，IM1 的水解涉及 20.4 kcal mol?1 的活化能壘（IM1’→TS3），這表明水解反應(yīng)可能是整個(gè)轉(zhuǎn)化過程中的速率決定步驟。

圖7 酶催化曼尼希反應(yīng)機(jī)制解析

總結(jié)

本文報(bào)道了一種簡單、高效的人工酶細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建策略，只需將非天然輔因子與細(xì)胞進(jìn)行短時(shí)間混合，即可在細(xì)胞內(nèi)成功構(gòu)建含非天然催化中心的目標(biāo)人工酶元件。該細(xì)胞內(nèi)人工酶在非天然不對稱曼尼希反應(yīng)中表現(xiàn)出顯著的催化活性，展現(xiàn)出優(yōu)異的對映體選擇性和廣泛的底物適用范圍。這種在細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建人工酶的策略，在克級規(guī)模合成非天然手性分子方面展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。晶體學(xué)分析與計(jì)算研究共同為理解人工酶催化反應(yīng)的立體選擇性和催化活性提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和機(jī)理見解。總體而言，這項(xiàng)工作提出了一種多功能且可推廣的方法，用于在細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建具有新功能的人工酶，該策略可廣泛應(yīng)用于擴(kuò)展人工酶的細(xì)胞內(nèi)催化能力，以實(shí)現(xiàn)多種非天然手性化合物的細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)，從而為在活細(xì)胞中構(gòu)建新型非天然生物合成途徑提供了一條有效的策略。

這一成果近期發(fā)表在Nature Communications上，江南大學(xué)周志教授和廈門大學(xué)王斌舉教授為論文共同通訊作者，江南大學(xué)博士生朱致熹、碩士生胡沁汝和廈門大學(xué)博士后吳瑤為論文共同第一作者。工作得到了科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金等項(xiàng)目的支持。

文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-026-75059-9?sessionid=-info

周志教授課題組主頁：https://www.x-mol.com/groups/zhouzhi