Cell Regen |?王凱團隊建立轉錄因子驅動的“合成血管類器官”分化新方案

血管是人體內負責輸送氧氣和營養的核心循環系統，同時在個體發育、組織修復及疾病發生發展中發揮著關鍵作用。人血管類器官作為一種新興的血管模型，在組織工程、疾病模擬和再生醫學中具有重要應用價值。然而，傳統構建方法多依賴外源性生長因子激活信號通路，存在異質性強、批次間穩定性差、成本高昂及培養周期長等問題。因此，如何在體外實現快速、穩定地生成均質化血管類器官，已成為該領域的研究熱點。

近日，北京大學基礎醫學院生理學與病理生理學系/血管穩態與重構全國重點實驗室/細胞穩態與衰老性重大疾病北京研究中心王凱課題組聯合北京大學第三醫院臨床干細胞研究中心/女性生育力促進全國重點實驗室王茜課題組以及哈佛醫學院/波士頓兒童醫院Juan Melero-Martin教授團隊合作在Cell Regeneration 上發表題為Generation of synthetic vascular organoids via orthogonal programming of human pluripotent stem cells的一套實驗方案。該方案利用雙轉錄因子正交編程策略對人多能干細胞進行改造，通過多西環素系統誘導，可在6天內快速生成細胞組成精確可控的“合成血管類器官”（Synthetic Vascular Organoids, Syn-VO），為血管生物學研究、藥物篩選和再生醫學提供了一個標準化的平臺。

1．血管細胞命運決定因子ETV2和NKX3.1

2006年，日本科學家山中伸彌教授利用病毒載體，首次將“山中伸彌四因子”（Yamanaka factors，OSKM）同時導入小鼠的成纖維細胞中，成功將其重編程為具備胚胎干細胞特性的iPSC。這項技術的突破性意義在于，它提供了一種獲取多能干細胞的新途徑，繞開了使用人類胚胎所帶來的倫理爭議，為疾病模擬、藥物篩選和再生醫學打開了新的大門。山中伸彌也因此獲得了2012年的諾貝爾生理學或醫學獎。能否在iPSC 中通過激活特定轉錄因子的方式正向驅動干細胞的分化，從而將干細胞正向編程為體細胞，這是個有趣的問題。

王凱研究員前期報道了在干細胞中瞬時激活ETV2，能高效驅動內皮細胞的分化，效率接近100%；瞬時激活NKX3.1可將中胚層祖細胞高效轉化為血管壁細胞祖細胞，與內皮細胞共移植后，可以在體內形成具有灌流功能的血管； 通過同時激活內皮細胞命運決定因子ETV2和血管壁細胞命運決定因子NKX3.1，實現了對血管類器官兩種核心細胞類型的獨立且同步的譜系控制。這解決了領域內長期存在的“共分化難”的問題：內皮細胞和血管壁細胞依賴緊密關聯但互不兼容的信號通路，傳統方法難以協同誘導。新方法可在5天內生成大小均一的血管類器官（傳統方法需3-4周），且無需細胞外基質包埋即可形成功能性血管結

2.ETV2和NKX3.1雙轉錄因子驅動“合成血管類器官”的分步實驗方案

2.1建立轉錄因子誘導過表達干細胞系

首先通過電穿孔將攜帶ETV2或NKX3.1編碼序列的轉座子載體，連同轉座酶質粒一起導入干細胞。兩者的表達均受多西環素（Dox）調控，只有當Dox存在時，轉錄因子才會被激活。電穿孔后的細胞經過兩輪嘌呤霉素篩選，富集了成功整合外源基因的細胞。隨后通過單克隆挑選和擴增，獲得基因型均一的穩定細胞系。候選克隆需經Dox誘導和HA標簽免疫染色驗證，只有大于99%的細胞呈HA陽性的克隆才被視為合格。整個建系周期約需一個月。

對于成功構建的iETV2和iNKX3.1細胞系，待其達到最佳融合度時，率先使用含有CHIR99021的S1培養基激活Wnt信號通路，驅動干細胞向中胚層方向分化。培養兩天以后，兩種細胞都成為中胚層祖細胞。隨后，將兩種細胞按照1：1的比例混合，轉移到非貼壁處理的六孔板中，加入含多西環素的S2培養基。此后，ETV2和NKX3.1同時被激活，一個調控細胞向內皮分化，一個調控細胞向壁細胞分化，互不干擾。在懸浮轉動條件下，細胞互相碰撞，自發聚集，形成三維球狀結構，到第6天，懸浮培養物中已然形成許多大小均勻的血管類器官。

作為對比，研究人員還制備了Chem-VO（也就是傳統利用化學小分子和生長因子制備的血管類器官）。通過對已經產生的中胚層祖細胞中加入含VEGFA、FGF2、EGF 和SB431542的S2培養基，置于搖床上進行3D懸浮培養。到第6天即可獲得Chem-VO。SB431542可以解除內源性TGF-β信號對內皮細胞分化的抑制，從而促進了內皮細胞的增殖、分化和成片。

對比兩種生成血管類器官的方法，可以明顯看出，依賴生長因子誘導的分化由于響應信號能力的差異，分化效率可重復性不如依賴轉錄因子激活調控高。同時，與Syn-VO可以精確控制最終產物中內皮細胞比例不同，在Chem-VO中，內皮細胞比例不可控，并且在不同批次和細胞系之間波動顯著。

2.2 建立報告系統實現血管類器官的可視化。

傳統方法觀察血管類器官，往往需要經歷固定、切片、免疫染色、組織透明化等步驟，不僅時間成本高，而且還有較高技術要求。更重要的是，這意味著一次實驗只能得到一個終點照片，我們無法追蹤血管網絡的動態生長過程。

為了打破這個限制，研究團隊通過CRISPR/Cas9基因編輯技術，在干細胞的基因組中做了兩處精準敲入，分別是在內皮細胞的特異性基因 PECAM1 的位點，敲入了一個 mRuby3 紅色熒光蛋白的編碼序列，和在壁細胞的特異性基因 ACTA2 的位點，敲入了一個 EGFP 綠色熒光蛋白的編碼序列。這樣一來，當干細胞分化成血管類器官時，內皮細胞會自發地發出紅色熒光，而周圍的壁細胞則會發出綠色熒光。

這套熒光報告系統實現了直接在共聚焦顯微鏡下實時追蹤，避免了繁瑣的免疫染色和組織透明化步驟。不僅體外培養可以實時觀察，在將類器官移植到小鼠腎被膜下后，同樣可以通過活體成像技術，無創地追蹤血管網絡在體內的整合與生長情況。

值得一提的是，王凱研究員團隊在2025年初發表于 Angiogenesis 期刊，題為A novel quantitative angiogenesis assay based on visualized vascular organoid的研究中，就已經利用該熒光報告系統成功評估了VEGFR抑制劑SU5416的抗血管生成效果，并篩選出了TGF-β、YAP、c-Met等多個信號通路的潛在調控劑。

2.3 建立功能性血管網絡

研究人員將第6天的Syn-VO包埋于水凝膠中，加入高濃度VEGF和FGF刺激。5天后，類器官向外出芽、分支，形成由紅色內皮和綠色壁細胞構成的血管網絡。整個過程無需染色即可在共聚焦顯微鏡下實時觀察。研究者用VEGFR抑制劑SU5416和促血管生成因子HGF驗證了該系統對藥物的響應，驗證了該模型高通量藥物篩選潛力。

隨后，將Syn-VO直接懸浮于PBS中，用胰島素注射器注射到小鼠腎被膜下，無需任何外源水凝膠或支架，2到4周后，形成了被宿主血液灌注的人源血管網絡。組織學分析證實，這些血管由人內皮細胞襯覆，周圍有壁細胞和IV型膠原基底膜包裹，結構完整、功能成熟。

綜上所述，這套方案建立了一個從基因編輯、類器官生成、熒光可視化到體外藥物篩選和體內移植驗證的完整技術流程。它通過正交編程策略，從根本上解決了傳統血管類器官分化方案效率低、細胞組成不可控、不同細胞系間差異大的痛點。基于雙熒光報告系統，研究者可以實時追蹤血管網絡的形成與動態變化，無需繁瑣的染色和透明化處理。這一平臺為藥物高通量篩選、患者特異性血管疾病建模以及共移植促進組織血管化提供了標準化的工具。從依賴生長因子誘導到直接控制轉錄因子，從“被動誘導”到“主動編程”，使得血管類器官的生成變得簡潔高效、靈活可控、可重復強。

北京大學基礎醫學院19級基礎八年制博士生趙云作為獨立一作，王凱研究員、王茜研究員和Juan M. Melero-Martin教授為文章的共同通訊作者。

原文鏈接：https://link.springer.com/article/10.1186/s13619-026-00298-6

制版人：十一

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