打破認知差：培養(yǎng)基干凈 ≠ 內(nèi)毒素安全，0.02 ng/mL 就能激活免疫反應

內(nèi)毒素是一種由細菌細胞壁分解產(chǎn)生的毒性物質(zhì),其主要成分為脂多糖（LPS），是細胞培養(yǎng)過程中不容忽視的問題。細胞培養(yǎng)試劑或介質(zhì)內(nèi)毒素過高，會干擾細胞的正常生長和分化，甚至導致實驗失敗。內(nèi)毒素通過誘導炎癥反應抑制細胞生長或誘導其凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，低濃度內(nèi)毒素（< 1 ng/mL，1 ng ≈ 10 EU）可刺激細胞產(chǎn)生細胞因子、激活小鼠巨噬細胞。

內(nèi)毒素如何偷偷毀掉細胞實驗？

細胞莫名其妙死亡、轉(zhuǎn)染效率低至 30%、同樣的 protocol 卻做不出重復結(jié)果——遇到這些問題，你的第一反應是什么？細胞狀態(tài)不好？血清批次有問題？轉(zhuǎn)染試劑不給力？

很少有人會想到這可能是內(nèi)毒素在「搗亂」。它隱藏在細胞培養(yǎng)基、添加物、質(zhì)粒中，難以被發(fā)現(xiàn)，卻悄無聲息地吞噬著實驗數(shù)據(jù)和結(jié)果。內(nèi)毒素可能從一開始就在那里，只是你從來沒測過。

你以為培養(yǎng)基澄清透明就是干凈的？你以為「內(nèi)毒素達標」就安全了？藥典標準是 0.5 EU/mL，但你的細胞實驗需要的，可能是比藥典嚴苛 10 倍的條件。內(nèi)毒素是細胞培養(yǎng)中最容易被忽視的「潛伏者」。它藏在血清里、藏在重組蛋白里、藏在質(zhì)粒里，悄無聲息地篡改你的實驗數(shù)據(jù)。這一次，我們來聊聊這個你「以為知道」、但可能低估了的隱形殺手。

一、0.02 ng/mL 的內(nèi)毒素就能對細胞培養(yǎng)產(chǎn)生影響

多種細胞易受內(nèi)毒素影響，如巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞、淋巴細胞、肝細胞、血小板、內(nèi)皮細胞等。極低濃度的內(nèi)毒素就能干擾細胞正常的生理功能。Schwarz H 等人發(fā)現(xiàn) 0.02～2 ng/m L的脂多糖（LPS）能激活細胞的免疫反應，且不同細胞對內(nèi)毒素的敏感度不一樣。如 THP-1 細胞在受到最高濃度 LPS（2 ng/mL）刺激時，僅 IL-8 表達量顯著增加，而在相同濃度下，moDCs 會大量分泌 IL-6、IL-8、IL-12 和 TNF-α。人單核細胞和 CD1c+ DCs 對內(nèi)毒素更敏感，0.2 ng/mL 的 LPS 能夠誘導所有細胞因子釋放。

0.02 ng/mL 是什么概念？相當于在標準游泳池里滴入一滴水，濃度低到可以忽略不計。但對于 THP-1 細胞、樹突狀細胞、原代免疫細胞來說，這個濃度的內(nèi)毒素足以讓它們「炸鍋」，細胞還沒開始正式實驗，就已經(jīng)被「提前激活」了。

低濃度 LPS 對不同人類免疫細胞細胞因子產(chǎn)生的影響（源自文獻：DOI:10.1371/journal.pone.0113840）

內(nèi)毒素能夠與細胞膜上的受體結(jié)合，激活免疫反應，釋放 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 等炎性細胞因子，影響細胞生理功能和信號通路紊亂，進而影響細胞生長和代謝，甚至造成細胞凋亡。內(nèi)毒素提前激活免疫細胞會干擾對細胞因子正常免疫調(diào)節(jié)功能的研究，出現(xiàn)實驗結(jié)果偏差。

內(nèi)毒素過高會造成細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，如體積縮小、折光率降低等。內(nèi)毒素還抑制細胞的增殖，如 G0/G1 期延長、S 期縮短等會導致細胞生長停滯或凋亡。內(nèi)毒素在敏感細胞中誘導 caspase-3 介導的凋亡通路，使原代細胞存活率驟降。內(nèi)毒素通過磷酸基團與細胞膜上的蛋白質(zhì)發(fā)生反應，或脂肪酸鏈與細胞膜上的脂質(zhì)膜和蛋白質(zhì)親水區(qū)發(fā)生作用，改變細胞膜形態(tài)，導致細胞功能障礙。

研究人員通過 MTT 法測定了脂多糖（LPS）對 H292 和 THP-1 細胞的毒性作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未處理的對照組相比，低濃度（1～2.5 μg/mL） LPS 處理后，細胞活力未觀察到顯著變化，表明此濃度下的 LPS 對細胞無毒性。而高濃度（5～20 μg/mL）的 LPS 對 H292 和 THP-1 細胞具有顯著的細胞毒性。

LPS 刺激對 H292 與 THP-1 細胞活力的影響（源自文獻：DOI：10.3892/mmr.2018.8542）

內(nèi)毒素對細胞功能有顯著影響，如影響細胞的基因表達、能量代謝和蛋白質(zhì)合成。內(nèi)毒素還會與轉(zhuǎn)染試劑、質(zhì)粒 DNA 降低細胞轉(zhuǎn)染效率。

因此，在細胞培養(yǎng)實驗中，內(nèi)毒素影響細胞的生理狀態(tài)和功能，降低實驗的可靠性和可重復性，此外，內(nèi)毒素的存在可能影響細胞因子和蛋白質(zhì)的表達控制，細胞信號通路、蛋白質(zhì)相互作用等研究需要注意內(nèi)毒素的干擾。對于細胞衍生產(chǎn)品（如疫苗、免疫細胞治療等）更應關注內(nèi)毒素污染。

二. 細胞培養(yǎng)過程中如何避免內(nèi)毒素污染

革蘭氏陰性菌是細胞培養(yǎng)環(huán)境中的常見污染源，細菌死亡裂解或?qū)е聝?nèi)毒素釋放。培養(yǎng)基中的血清或蛋白質(zhì)成分含有較高內(nèi)毒素也會影響細胞生長。在細胞的傳代、凍存等環(huán)節(jié)操作不當也會導致內(nèi)毒素污染。細胞培養(yǎng)所有容器和包裝材料也會因制造工藝而含有內(nèi)毒素。

針對內(nèi)毒素污染的來源，可以通過以下措施控制內(nèi)毒素：

原料控制：選擇低內(nèi)毒素或超低內(nèi)毒素的試劑和介質(zhì)，從源頭控制內(nèi)毒素。

細胞株選擇：某些腫瘤細胞株對內(nèi)毒素敏感度較低可優(yōu)先選擇。

培養(yǎng)環(huán)境選擇：定期殺菌和在位清洗，減少大腸桿菌污染。優(yōu)化細胞培養(yǎng)條件，如溫度、pH 值、滲透壓等，以降低內(nèi)毒素對細胞的不良影響。

質(zhì)量控制：對所用試劑進行內(nèi)毒素檢測，保證內(nèi)毒素含量符合標準。

人員培訓：確保操作合規(guī)，避免人員操作問題引入細菌內(nèi)毒素。

三、重組蛋白內(nèi)毒素對細胞培養(yǎng)的影響

重組細胞因子在細胞培養(yǎng)和擴增分化過程中具有重要作用。免疫學實驗、細胞凋亡實驗、干細胞培養(yǎng)與分化、類器官模型構(gòu)建等，都需要使用低水平內(nèi)毒素的細胞因子。細胞因子功能分析、蛋白互作研究，使用更低水平內(nèi)毒素的重組蛋白是獲取可靠實驗結(jié)果的基礎。

為評估重組蛋白中內(nèi)毒素對細胞的免疫反應，Schwarz H 等人構(gòu)建了對 LPS 高度敏感的 HEK293 細胞，將這些細胞分別暴露于不同濃度的重組蛋白（來自兩個不同的供應商）和 LPS 中。結(jié)果顯示，供應商 1 的重組蛋白可使 NF-kB 表達量升高，而供應商 2 的重組蛋白則未激活 NF-kB 表達。供應商 1 重組蛋白誘導 NF-kB 表達的效果與 0.02 ng/mL LPS 相近，說明重組蛋白中少量內(nèi)毒素污染（1.4 EU，0.014 ng/100 ng 蛋白）足以激活 NF-κB 通路。

內(nèi)毒素對 HEK293 細胞中 NF-kB 激活的影響（源自文獻：DOI:10.1371/journal.pone.0113840）

內(nèi)毒素污染自查清單

你中了幾條？

以下場景，如果你中了 3 條以上，你的實驗數(shù)據(jù)可能正在被內(nèi)毒素「偷走」。

試劑耗材篇

用的重組蛋白、細胞因子，從來沒測過內(nèi)毒素水平

只知道內(nèi)毒素「達標」（< 0.5 EU/mL），不知道自己的細胞需要多低的閾值

血清分裝后反復凍融，瓶口有肉眼可見的殘留

用的超純水，超過一周沒換機、沒測電阻率

日常操作篇

培養(yǎng)基配制后，存放超過兩周還在用

槍頭、離心管是「國產(chǎn)某品牌」，但沒驗證過無熱原

開瓶后的試劑，瓶蓋朝下放在臺面上

細胞房里的酒精棉球，泡了三天沒換

培養(yǎng)環(huán)境篇

培養(yǎng)箱水盤里的水，一個月沒換過

細胞房最近有過細菌污染，簡單消殺后繼續(xù)用

同一瓶培養(yǎng)基，同時養(yǎng)免疫細胞和腫瘤細胞

做原代細胞培養(yǎng)，沒單獨配一瓶「專用培養(yǎng)基」

細胞狀態(tài)篇

細胞長得慢，第一反應是「血清不行」，而不是測一下內(nèi)毒素

轉(zhuǎn)染效率突然下降，懷疑是質(zhì)粒問題，沒想過是內(nèi)毒素干擾

同樣 protocol，兩個人做出來結(jié)果不一樣，以為是操作問題

細胞形態(tài)沒變、培養(yǎng)基也沒渾，就默認「沒問題」

如果你中了 3 條以上，建議下次實驗前，先測一下你的培養(yǎng)基、血清、重組蛋白——內(nèi)毒素這個「隱形殺手」，可能比你想象的離你更近。自查清單里那些「坑」，有些靠規(guī)范操作就能填上——比如勤換水、不反復凍融、分區(qū)使用培養(yǎng)基。但有些問題，不是操作能解決的：你用的重組蛋白本身自帶內(nèi)毒素，換再多槍頭、擦再多遍臺面也沒用。這時候就需要從源頭入手——選擇真正「超低內(nèi)毒素」的試劑，而不是只看標簽上寫著「達標」。

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義翹神州位于德克薩斯州的生物工程中心（C4B）采用先進的技術和設備生產(chǎn) ProPure? 超低內(nèi)毒素蛋白，內(nèi)毒素水平低于定量限（BQL）（< 0.05 EU/mg），顯著優(yōu)于行業(yè)標準（USP <85>：0.5 EU/mg），適用于臨床前動物研究、嚴格的細胞實驗與高敏檢測分析。同時，C4B 還提供超低內(nèi)毒素蛋白定制服務，滿足臨床前和藥物開發(fā)中對內(nèi)毒素控制的更高標準需求。

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內(nèi)容策劃：王丹琦

內(nèi)容審核：周育紅

題圖來源：圖蟲創(chuàng)意

參考文獻：

[1] Schwarz H, et al. Residual Endotoxin Contaminations in Recombinant Proteins Are Sufficient to Activate Human CD1c+ Dendritic Cells. PLoS ONE. 2014. doi:10.1371/journal.pone.0113840

[2] Xuefang Liu, et al. LPS?induced proinflammatory cytokine expression in human airway epithelial cells and macrophages via NF-κB, STAT3 or AP-1 activation. Mol Med Rep. 2018. doi: 10.3892/mmr.2018.8542